细胞DNA修复系统与肿瘤发生及化疗耐药性

吕 申

(大连医科大学 附属第二医院 实验中心，辽宁 大连 116027)

基因组完整与稳定是维持细胞正常生存行使功能的基础。在生命过程中，人类细胞基因组总是不可避免地会受到来自体内外环境的物理、化学、生物等因子的损伤，如：紫外线、放射线、烟雾、细胞代谢产生的氧自由基、病毒等。同时在细胞增殖的DNA复制过程基因组也会发生一些错误。为了维持基因组的稳定，生物体在进化过程中形成了一整套完整的DNA损伤修复系统。这一系统中的DNA损伤修复方式主要有3种：核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)、碱基切除修复(base excision repair, BER)和DNA错配修复(mismatch repair, MMR)。这些修复方式所涉及参与DNA修复的基因有130多个，如切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing gene l, ERCC1 )、X线修复交叉互补基因1(X- ray cross-complementing gene l, XRCC1)、多个错配修复基因、O6-甲基鸟嘌呤- DNA甲基转移酶基因(MGMT)等。这些基因中的某一个或某几个出现结构或功能异常时，细胞的DNA修复功能就会发生缺欠，进而细胞基因组中未能得以修复的“错误”将不断积累，细胞基因组的完整性和稳定性也就难以得到保证。这些“错误”将可能使一些抑癌基因失活，也可能使一些原癌基因被激活，最终导致肿瘤发生。近年来人们发现肿瘤细胞的DNA修复功能状态不仅与肿瘤发生相关，也与肿瘤化疗耐药性的产生有关。

1 ERCC1基因

1.1 ERCC1基因结构、功能及多态性

ERCC1基因定位于染色体的19q13.32，全长15 kb，含有10个外显子。该基因编码的蛋白分子量为32.5 kDa，由297个氨基酸组成，是一种高度保守的单链DNA核酸内切酶，是核苷酸切除修复系统中的主要蛋白。ERCC1蛋白通过与其他的修复蛋白形成蛋白复合体，发挥识别损伤DNA 的5’端及5’- 3’核酸内切酶活性，参与修复由紫外线引起的嘧啶二聚体、大分子化学加合物及一些其他光产物引起的DNA损伤。

ERCC1基因比较常见的单核苷酸多态有两种，分别为第4外显子的T19007C和3’非编码区的C8092A。目前，报道较多的是第4外显子的T19007C，它会导致118号密码子的编码序列发生改变。虽然118号密码子的编码序列发生了改变后的编码氨基酸仍然是天冬酰胺，但值得注意的是，这一转变使ERCC1基因的转录水平降低，细胞的ERCC1蛋白表达也随之降低，最终引起细胞核苷酸切除修复能力的降低。ERCC1基因3’非编码区的C8092A转变可能通过使ERCC1 mRNA转录受到抑制或者使mRNA稳定性降低而导致细胞的DNA核苷酸切除修复能力降低。

1.2 ERCC1基因异常与肿瘤发生

目前，关于ERCC1基因多态性与人类肿瘤发病风险关系的研究有很多，但研究结果尚不统一。种族或肿瘤类型常使研究结果出现分歧。Zienolddiny S等[1]发现，ERCC1基因T19007C多态性与挪威人非小细胞肺癌发病有关，而Zhou W、Matullo G及Vogel U等[2-4]则认为该多态与丹麦人、美国人及不吸烟欧洲人的非小细胞肺癌发病无关。Jo H及Han SS等[5-6]研究发现，ERCC1基因T19007C多态性与韩国人群卵巢癌及子宫内膜癌发病均无关，而且在后来的研究中该实验组也并未发现该多态性与韩国人群宫颈癌发病有关。另外，Sturgis EM及Yang ZH等[7-8]研究提出，ERCC1基因的C8092A多态性与美国人群的头颈鳞状细胞癌及中国人群的鼻咽癌发病密切相关，但Zienolddiny S及Weiss JM等[1,9]研究者则发现，该多态性与挪威人群非小细胞肺癌及美国人群子宫内膜癌发病无关。

1.3 ERCC1基因与化疗

铂类是常见的抗肿瘤药物之一，其作用的靶点为细胞内的DNA，通过形成铂-DNA加合物，破坏DNA的结构，抑制DNA的复制及转录，达到抑制肿瘤细胞生长的目的。如前所述，ERCC1蛋白参与修复一些大分子加合物引起的DNA损伤，理论上该蛋白可以使细胞内的铂-DNA加合物得以有效清除，导致肿瘤细胞对铂类耐药。这一理论已被一些研究结果证实。 Kawashima A等[10]检测了4例体外培养膀胱癌细胞株(其中2例为顺铂耐药株)的ERCC1蛋白表达，发现顺铂耐药细胞的ERCC1蛋白表达水平高于非耐药株；一些学者对卵巢癌细胞株的研究也证实，顺铂耐药的细胞株ERCC1 mRNA及蛋白表达水平均高于未接受化疗的细胞株[11]；Olaussen等[12]进行的临床试验观察发现，与ERCC1蛋白表达阳性非小细胞肺癌的患者相比，该蛋白表达阴性的患者更容易从以顺铂为主的化疗中受益；Bellmunt等[13]也报道，以顺铂进行治疗的ERCC1 mRNA 低水平的进展期膀胱癌患者预后明显优于ERCC1 mRNA 高水平的患者。由此提示，ERCC1 mRNA或蛋白表达水平的高低对筛选铂类治疗肿瘤患者的敏感人群具有一定的指导作用。

2 XRCC1基因

2.1 XRCC1基因结构、功能与多态性

XRCC1基因是第一个被克隆出来的参与单链断裂修复的人类基因，它定位于染色体的19q13.2，全长33 kb，含有17个外显子。其编码蛋白由633个氨基酸组成，分子量为70 kDa，在大肠组织表达水平较高，而在其它组织的表达水平较低。XRCC1蛋白表达较低的细胞对电离辐射、过氧化氢、烷化剂等损伤的敏感性较高。XRCC1蛋白是碱基切除修复系统的主要蛋白，虽然本身没有催化酶的活性，但是它具有的三个功能区可以与DNA连接酶III、DNA聚合酶β、聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶(PARP)结合形成复合物，修复由氧化剂、电离辐射及烷化剂引起的碱基损伤及DNA单链断裂。

对XRCC1基因DNA序列分析发现，该基因有300多个单核苷酸多态性位点，其中约有35个多态位点位于外显子或启动子区域。研究最多的3个单核苷酸多态性位点分别是第6外显子的C26304T、第9外显子的G27466A和第10外显子的G28152A。它们可以导致氨基酸残基发生相应的改变(Arg194Trp、Arg280His 、Arg399Gln)。这些编码区氨基酸序列的改变通过影响XRCC1蛋白与BER系统中其它蛋白的相互作用使细胞的DNA修复功能发生变化。

2.2 XRCC1基因与肿瘤发生

大量研究结果表明一些基因的多态性可能影响人群的肿瘤发病风险。目前，虽然XRCC1基因单核苷酸多态与肿瘤易感性的相关研究较多，但研究结果尚未得到共识。该基因的同一种单核苷酸多态可以增加一些肿瘤的发病风险，但却能降低另一些肿瘤的发病风险。例如，Arg194Trp单核苷酸多态可以增加食管癌及胆管癌的发病风险，但可以降低胃癌的发病风险；Arg280His单核苷酸多态被认为与乳腺癌发病风险增加有关，而与胆管癌发病风险降低有关；Arg399Gln单核苷酸多态被认为与日本人女性子宫颈癌易感性增高有关。

Hung RJ 等[14]对来自三项研究的2 188例肺癌病例及2198例对照进行荟萃分析，发现Arg194Trp、Arg280His 和Arg399Gln三种单核苷酸多态均与肺癌发病风险的关联不大，但根据吸烟量进行分组研究时发现，在重度吸烟组(每年吸烟量>38.26包)，Arg194Trp和Arg280His的单核苷酸多态与肺癌发病风险降低有关。Susana N等[15]报告，Arg194Trp与Arg399Gln单核苷酸多态与乳腺癌发病风险关联不大，一些研究者也发表了相似的研究结果，但一项印度的研究却报道这两个位点的单核苷酸多态与乳腺癌发病风险增高相关[16-18]。这些研究结果的差异可能与不同地区、不同人种XRCC1基因多态性发生频率高低有关。Susana N等进一步研究发现，绝经年龄在45～55岁之间患者的Arg194Trp单核苷酸多态及绝经年龄55岁以上患者的Arg399Gln单核苷酸多态会显著增加乳腺癌发病风险。该发现提示女性绝经状态可能是影响XRCC1蛋白修复功能的一个重要因素。

2.3 XRCC1基因与化疗

鉴于XRCC1基因多态性会影响细胞的DNA修复能力，该基因常见的单核苷酸多态与肿瘤化疗反应的关系已引起了研究者们的关注。多项研究结果提示XRCC1基因多态性的确与多种肿瘤的化疗反应有关，但研究结果仍然存在一些分歧。Wang等[19]对接受铂类药物化疗的105例非小细胞肺癌患者进行临床研究发现，携带194Trp/Trp或194Arg/Trp基因型患者的化疗效果明显优于携带194Arg/Arg基因型患者，而携带399Arg/Arg基因型患者的化疗效果明显优于携带399 Arg/Gln或399Gln/Gln基因型患者；Shi MQ等[20]研究发现，携带194Arg/Arg基因型的进展期肺癌患者对铂类药物化疗的耐药风险是携带194Trp/Trp基因型患者的5倍，但没有发现399密码子多态与患者化疗反应有关；Moreno V等[21]报道，携带399Gln/Gln基因型的大肠癌患者的化疗反应优于携带399Arg/Arg或399 Arg/Gln患者。尽管造成上述结果的差异尚未完全清楚，但检测XRCC1基因多态及其蛋白表达将可能会对筛选某些细胞毒性药物的受益人群有所帮助。

3 MMR基因

3.1 MMR基因结构与功能

MMR主要参与修复DNA复制过程中形成的单碱基错配及插入/缺失环。 MMR系统中识别错配DNA的MutS同源物命名为hMSH(human MutS homologs)，主要包括hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、hMSH6，构成两种异源二聚体：MutSα和MutSβ。MutSα由hMSH2和hMSH6构成，主要功能是识别单碱基错配(G/T，A/C)、短的插入/缺失环，同时还能诱导细胞凋亡，是MutS的主要功能行使者；MutSβ由hMSH2和hMSH3组成，主要功能是识别较大的插入/缺失环，这两种复合物的功能具有一定程度的重叠。MMR系统中的MutL同源物命名为hMLH(human MutL homologs)，主要包括hMLH1、hPMS1、hPMS2，构成三种异源二聚体：MutLα、MutLβ和MutLχ。MutLα由hMLH1和hPMS2构成，是hMLH最主要的异源二聚体形式，主要参与纠正单碱基错配及插入/缺失环，也在细胞减数分裂过程中发挥重要作用；MutLβ由hMLH1和hPMS1构成，该复合物在人类DNA错配修复过程中的具体作用尚不明确；MutLχ由hMLH1和hMLH3构成，由于hMLH3的缺失并不会损伤MMR系统的功能，因此MutLχ并不是细胞DNA错配修复所必须的。值得注意的是，hMSH2及hMLH1是上述多种复合物的基本成员，二者中任何一个出现结构或功能的异常均可能导致细胞MMR功能的降低甚至丧失。而复合物中的其他成员丢失(如hMSH6)只会减弱MMR系统纠正单碱基错配及插入/缺失环的功能。

3.2 MMR基因与肿瘤发生

MMR系统功能缺失可以由突变、缺失或错配修复基因后天性沉默等多种因素引起。MMR功能缺失使细胞不能有效修复DNA复制时出现的错误，这些错误的累积造成基因突变发生频率的增高，进而导致细胞基因组的不稳定，尤其见于DNA序列中的一些短串联重复序列(微卫星)，即，微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)。研究证实，MMR功能缺失普遍见于大肠癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤[22-25]。HNPCC的MMR功能缺失主要是由于错配修复基因hMLH1、hMSH2及hMSH6突变引起的，hMLH1、hMSH2突变约占所有突变的90%，hMSH6突变占所有突变的10%。散发性大肠癌MMR功能缺失则是由hMLH1启动子超甲基化引起的基因沉默所致。本课题组的研究发现，胃癌等消化道肿瘤以及肺癌肿瘤细胞常出现MMR蛋白表达的增高[26-29]。这与他人的一些研究结果好像存在一定的差异，在逻辑上似乎也存在一定的矛盾。人们一定会问： MMR蛋白表达增高细胞基因组中的突变怎么还会增多？如果从相反的方向考虑，将可能得到比较合理的解释。肿瘤细胞多处于DNA复制的细胞增殖状态，此时细胞基因组中的碱基错配增多，基因组稳定性减弱，为维护细胞的基因组稳定性及遗传保真性，细胞需要通过加强MMR蛋白表达来增强对错配的修复，也就是说肿瘤细胞中的MMR蛋白表达增多可能是碱基错配增多的结果，而不是原因。可见，MMR蛋白表达的增高和降低均可能成为肿瘤预警的标志。

3.3 MMR基因与化疗

大量体外实验提示，MMR功能缺失与肿瘤的铂类药物耐药发生有关。研究发现，hMLH1功能缺失的大肠癌细胞株HCT116和hMSH2功能缺失的子宫内膜癌细胞株HEC59对顺铂耐药程度分别是hMLH1和 hMSH2功能正常细胞株的2.1倍和1.8倍[30]。这可能是由于MMR功能缺失除了能够引起非编码序列的突变外，也能引起控制药物敏感性基因的突变，从而引起对化疗药物耐药。也有学者提出了无效循环模型来解释为什么与MMR功能正常的肿瘤细胞相比，MMR功能缺失的肿瘤细胞更易出现对化疗药物耐药现象，这可能是由于MMR功能正常时能够识别并切除铂类药物引起的DNA损伤，另一条链仍然被保存，并作为模板链进行新DNA链的合成，但由于DNA损伤仍然被保留下来，故引起错配的无效循环，最终引起细胞死亡，而MMR功能缺失时，铂类药物引起的DNA损伤就不能被识别和切除，细胞继续存活，继而产生耐药现象。但也有研究发现，MMR功能缺失的神经胶质瘤细胞对替莫唑胺等化疗药物不耐药[31]。综上，MMR功能缺失的肿瘤细胞是否容易产生耐药，可能因肿瘤细胞分子类型或药物种类而异。这一问题，将可能成为肿瘤耐药性研究的热点。

4 MGMT基因

4.1 MGMT基因结构与功能

O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因是一种DNA修复基因，定位于染色体 10q26，基因全长约 170 kb，由 5个外显子以及 4个内含子构成。该基因编码的蛋白由207个氨基酸组成，是一种特殊的DNA损伤修复蛋白，通过将DNA分子中的O6-甲基鸟嘌呤上的甲基转移到自身的半胱氨酸残基上而达到修复DNA的目的。因此，MGMT蛋白可保护染色体免受烷化剂的致突变、致癌和细胞毒作用的损伤，而且有足够证据表明该蛋白表达缺失时会显著增加G-A突变频率，尤其是K-RAS基因。

4.2 MGMT基因与肿瘤发生

研究发现，MGMT蛋白表达缺失可能与恶性胶质瘤、食管癌、大肠癌等恶性肿瘤的形成有关[32-34]。现已证实，基因缺失、突变、重排并不是MGMT蛋白表达缺失的主要原因，而MGMT基因启动子CpG岛超甲基化则是其编码蛋白表达缺失的最主要机制。

Fritz G等[35]研究发现，烷化剂、吸烟、X射线等致DNA损伤的外源性因素能够上调细胞内MGMT蛋白表达。另有研究发现，MGMT蛋白在甲状腺癌及大肠癌组织中的表达显著高于癌旁黏膜[36-37]。本课题组前期实验发现，非小细胞肺癌组织、大肠癌组织MGMT蛋白表达显著高于癌旁组织，国内吕金芳等的研究也得出了相似的结果[29,38-39]。这些研究结果提示，MGMT蛋白高表达可能是诊断肿瘤的一个参考指标。而这些结果与之前提到的MGMT蛋白表达缺失与肿瘤形成有关似乎有矛盾，当然这一矛盾可能是由于研究人群种族差异所致，然而，从不同的角度(原因及代偿性结果)进行考虑也可以得到合理的解释。同另几种DNA修复蛋白一样，MGMT蛋白表达的增高和降低亦都可以是肿瘤预警的标志。

4.3 MGMT基因与化疗

烷化剂是治疗神经胶质瘤、恶性黑色素瘤、淋巴瘤等很多恶性肿瘤的主要化疗药物，但其作用效果受肿瘤细胞DNA修复机能的影响。大量的临床前体内及体外实验数据提示，这类药物主要是通过促使DNA分子上O6-甲基鸟嘌呤形成杀死肿瘤细胞，而MGMT蛋白则通过对损伤部位的修复使肿瘤细胞对这类化疗药物耐药。研究表明，细胞对烷化剂的敏感性与其MGMT活性负相关，MGMT功能缺陷的细胞对烷化剂引起的细胞毒作用或者致突变作用比较敏感。更值得注意的是，MGMT敲除鼠对烷化剂所引起的细胞毒作用比较敏感，而MGMT过表达鼠则对烷化剂耐药[40]。Lin JW等[41]研究发现，MGMT 蛋白表达缺失与胶质瘤患者烷化剂药物治疗敏感有关。由于启动子甲基化常是MGMT表达降低的原因，所以MGMT启动子甲基化状态可能是预示肿瘤烷化剂化疗成败的一个因素，检测其甲基化状态有助于筛选能够从烷化剂治疗中受益的肿瘤患者。

5 展 望

DNA修复蛋白功能异常时细胞不能有效修复基因组的错误，致使错误不断累积，最终发生恶性转化，形成肿瘤。目前有关DNA修复功能异常与肿瘤发生关系的研究结果存在很大分歧。例如：在不同类型组织，ERCC1及XRCC1的基因多态性与肿瘤易感性并无明确相关性，MMR及MGMT蛋白表达异常与不同类型肿瘤发生的关系也无定论。值得注意的是MMR及MGMT蛋白表达缺失不仅与多种肿瘤的发生密切相关，肿瘤细胞也常出现它们的高表达，甚至在癌旁组织也常出现它们的高表达。这提示尽管MMR及MGMT蛋白表达对具体肿瘤的诊断作用尚未明确，但它们表达的增高或降低都可能成为恶性肿瘤诊断的标志。这方面的相关研究将可能成为肿瘤临床研究的热点。

化疗是大多数晚期肿瘤患者或者经过手术切除但没有得到完全根治患者的主要治疗方法，该方法能够在一定程度上延长肿瘤患者的生存时间，但较强的毒副作用及耐药性产生使化疗的临床应用受到限制。如何为肿瘤患者筛选出最佳化疗药物已成为临床亟待解决的问题。DNA修复功能异常不仅与肿瘤发生密切相关，也与肿瘤化疗耐药性产生密不可分。因此，检测肿瘤细胞DNA修复蛋白表达对确定肿瘤患者的临床用药将有一定的指导作用，但如何指导某一特定肿瘤患者的个体化用药尚需临床医生与基础研究者的进一步共同艰苦努力，从而为肿瘤患者提供有的放矢的个体化治疗，有效地减少化疗药物的毒副作用及耐药性产生。

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