甘蔗近缘属斑茅组织培养高频再生体系的建立

吴转娣，刘家勇，陆鑫，张敏，林秀琴，赵培方，吴才文

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远616600）

甘蔗近缘属斑茅组织培养高频再生体系的建立

吴转娣，刘家勇，陆鑫，张敏，林秀琴，赵培方，吴才文

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远616600）

以甘蔗近缘属植物斑茅的幼嫩叶片为材料，研究MS、SH、B5三种基本培养基和不同激素（2，4-D、NAA、6-BA）配比对斑茅愈伤组织诱导及继代培养的影响，并筛选出斑茅细胞高频再生体系的最优培养基配方。研究结果表明，斑茅幼嫩叶片愈伤组织诱导培养基以MS+2，4-D 3.0mg/L+6-BA 0.4mg/L为最适，愈伤组织继代培养基以MS+2，4-D 3.0mg/L为最适。在此条件下诱导的愈伤组织质地疏松，具有较强的分化能力。目的是建立斑茅组织培养的高频再生体系，为斑茅材料的细胞悬浮培养、染色体加倍和细胞融合等研究提供一定参考。

斑茅；组织培养；高频再生体系

斑茅（Erianthus arundinaceus）是甘蔗近缘属植物，染色体为2n=30、40、60，因生势强、具有抗干旱、抗寒、抗病虫、耐瘠薄及宿根性强等特点，成为甘蔗育种的重要基因资源，在甘蔗育种中具有较为特殊的育种价值和应用潜力[1-2]，在甘蔗育种研究中倍受关注，人们希望把斑茅的优良性状基因导入甘蔗栽培种，改良栽培种的抗逆性、适应性和宿根性。目前利用斑茅杂交已经获得了杂种后代并育成新品种。然而在斑茅杂交的利用过程中，我们发现其后代的可育性差、真实杂种的鉴定难等一系列问题[3]。随着基因重组技术的出现，斑茅抗性基因挖掘和分离、染色体加倍和细胞融合等就成为了利用斑茅培育新品种的新途径。云南省农科院甘蔗研究所依托国家甘蔗种质资源圃的资源优势，保存了2000多份甘蔗种质资源材料，其中斑茅约200份[4]。而在国内还未见有适宜于斑茅的组织培养高频再生体系的相关报道。笔者以多份斑茅材料的幼叶为外植体，研究在不同的培养基上诱导斑茅的愈伤组织及继代培养愈伤组织，进而建立组织培养高频再生体系，以期为利用愈伤组织或悬浮细胞培养进行细胞加倍或细胞融合等的研究打下一定的基础[5]。

1 材料与方法

1.1 材料

以云南省农科院甘蔗研究所国家甘蔗种质资源圃内保存的云南83-197、云南95-14、四川79-1-2三份斑茅资源为实验材料。

1.2 方法

1.2.1 基本培养基的筛选和愈伤组织的诱导取回斑茅的顶端分生区约50cm长，第一次剥开部分老的叶鞘，保留材料下端（顶芽部分）完整，切除多余的老叶鞘，约25～30cm，以75%乙醇溶液消毒表面，放入超净工作台中，剥去老叶鞘，在无菌报纸上切去老的叶鞘剩下10cm长的幼嫩叶鞘，此时能在材料的上端看到两片叶脉，外表面无毛，离材料下端2～3cm处有一个叶鞘与叶片连接的肥厚带，即材料已经剥到位，将材料切片，置于培养基上培养。

将外植体分别接种在MS+2，4-D 3.0mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L；SH+2，4-D 3.0mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L；B5+2，4-D 3.0mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L培养基上，观察不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响，选出最优基本培养基。

以MS为基本培养基，6-BA、2，4-D、NAA、KT不同梯度浓度进行愈伤组织诱导、愈伤组织继代和愈伤组织分化培养3种培养基，培养基中蔗糖质量浓度均为30g/L，琼脂0.4%，pH均为5.8。愈伤组织诱导、愈伤组织继代均为暗培养，温度均为25±2℃。分化培养则在光照度为1000～2000lx的光照条件下，25±2℃培养。设计18种不同激素组合的诱导培养基（见表1），每种组合10皿，每皿接种外植体约16块（分别来自3个不同的斑茅材料），暗培养15～25d观察生长情况，全部材料一皿换一皿继代1次观察并统计诱导愈伤的情况，分好、较好、中、不好四类统计结果。

1.2.2 愈伤组织继代培养基的筛选选取长势好的愈伤组织，在以MS+3.0mg/L 2，4-D为基本培养基，添加不同量的NAA、6-BA。继代培养接种量约为2g/块，接种约10块，连续继代3次，每次15d继代1次，15d后取样称重，每个处理3次重复，结果取平均值。

1.2.3愈伤组织的分化培养取连续继代3次，质地疏松易碎的愈伤组织，接种于MS+KT 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L培养基中分化培养，观察苗分化的情况，并记录。

表1 不同激素组合对斑茅愈伤组织诱导的影响

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响

叶片外植体在3种基本培养基上均能诱导出愈伤组织，以SH培养基启动最快，培养5d的材料组织膨大，呈淡黄色，褐化材料不多，15d生长较好的叶片外植体周围长出淡黄色的愈伤组织，生长较差的叶片外植体变黑，约20d继代1次，愈伤生长加快愈伤生长量增加，愈伤鲜黄继代后15d统计诱导结果显示，在MS基本培养基上诱导率最高，为78%，且出愈伤时间最短，约15d，而B5、SH基本培养基上的诱导率偏低，分别为52%和32%，褐化比较严重，出愈伤时间分别在18d和22d。因此我们采用MS培养基为基本培养基。

2.2 不同激素组合对愈伤组织诱导的影响

以MS培养基为基本培养基，观察不同激素组合对斑茅叶片愈伤组织诱导培养的影响（激素组合见表1）。结果发现，以2，4-D 3.0 mg/L诱导效果最好，其中2，4-D 3.0 mg/L+BA 0.4 mg/L的激素组合中愈伤的生长情况最好。

2.3 不同激素对愈伤组织继代培养的影响

以MS+2，4-D 3.0 mg/L为基本培养基，继代培养3次，每15d换1次培养基，观察6-BA和NAA的添加量对斑茅愈伤组织继代培养的影响（激素添加情况见表2）。结果发现，与添加了NAA或6-BA的培养基相比，不添加的培养基更加适合于继代培养。以MS+2，4-D 3.0 mg/L的培养基中继代培养的诱导效果最好，愈伤的生势好，愈伤质地松，呈淡黄色颗粒状。

2.4 愈伤组织的分化培养情况

将在MS+2，4-D 3.0mg/L培养基中继代过3次，质地疏松易碎的愈伤组织，接种于MS+KT 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L培养基中进行分化培养，结果显示：愈伤组织的分化能力强，在分化培养过程中没有出现褐化死亡的现象，具有较强的分化能力。

表2 不同激素对愈伤组织继代培养的影响

图1斑茅幼叶愈伤组织培养、继代培养及分化培养

3 讨论

斑茅是甘蔗育种研究中重要的野生资源，其生物量大，抗性强，是甘蔗品种活力和抗逆性基因源的主要提供者，因此建立斑茅的组织培养高频再生体系具有重大的研究意义。在对斑茅进行组织培养过程中，发现斑茅材料在第一次愈伤诱导过程中褐化严重，因此本实验在愈伤诱导时均添加了40mg/L PVP。不同2，4-D浓度对斑茅材料的影响较大，在继代培养时不宜改变2，4-D的浓度，同时在继代培养过程中不要继代多于5次，否则愈伤组织的活力不强，影响后续的实验。

[1]程天聪.云南甘蔗种质资源考察及有性杂交育种研究[J].西南农业学报，1992，5（1）：14-19.

[2]何顺长，杨春辉，肖凤迥，等.全国甘蔗野生种质资源的采集与考察[J].甘蔗，1994（1）：11-17.

[3]郑雪芳，张木清，李奇伟，等.甘蔗斑茅的杂交利用及其杂种后代鉴定系列研究（二）：甘蔗斑茅远缘真实杂种的分子鉴定[J].分子植物育种，2004，2（1）：35-42.

[4]王丽萍，蔡青，范源洪，等.甘蔗（Saccharum）与斑茅（Erianthus arundinaceus）远缘杂交利用研究[J].西南农业学报，2007，20（4）：721-726.

[5]Kenia Tiel，Gil A Enriquez，YanaysiCeballo etal.Developmentof a system for rapid plant regeneration from in virtro sugarcane（Saccharum officinarum L.）meristematic tissue[J].Biotecnologia Aplicada，2006，23（1）：22-24.

Establishing High Frequency Regeneration System of Related Genera of Saccharum（Erianthus arundinaceus）

WU Zhuan-di，LIU Jia-yong，LU Xin，ZHANGMin，LIN Xiu-qin，ZHAO Pei-fang，WU Cai-wen
（Yunnan Province Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement /Sugarcane Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kuaiyuan 661600，China）

The young leaves of Erianthus arundinaceus were used to study the effects of basic media and the phytohormone combination（2,4-D、NAA、6-BA）on callus induction as well as subculture of the callus,and to screen out the best cultural formula for high frequency regeneration system of Erianthus arundinaceus.The results showed thatmost suitable medium for callus induction was MSwith 3.0 mg/L 2,4-D and 0.4 mg/L 6-BA.MS with 3.0 mg/L 2,4-D was as the best subculture medium formula，the callus was loose and had stronger differentiation ability under those conditions.The purpose of the experiment was to establish a high frequency regeneration system of Erianthus arundinaceus，and provided a reference for the Erianthus arundinaceus's research，as the cell suspension culture，chromosome doubling and cellular fusion.

Erianthus arundinaceus；tissue culture；high frequency regeneration system

S566.103

A

1007-2624（2012）02-0009-02

2012-01-28

现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-20-1-1）。

吴转娣（1982-），女，广东省江门市人，研究实习员，主要从事甘蔗基因工程育种研究，E-mail：judith1123@126.com。

吴才文，E-mail：gksky_wcw@163.com