干细胞疗法治疗炎症性肠病的应用

姜海燕，曲 波，金世柱

哈尔滨医科大学附属第二临床医院消化内科，黑龙江哈尔滨150086

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)至今病因未明，发病机制复杂，近年来，其发病率在我国有逐年上升趋势。虽然我国仍未有以人群为基础的IBD流行病学调查报告，但近十年来有关临床报道及系统分析研究表明IBD病例数量上升了约3.1倍，其中溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)患病率约为11.6/10 万，而克罗恩病(Crohn’s disease，CD)患病率则为1.38/10万［1］。IBD病程迁延、反复发作，多数患者因疼痛使生活质量受到严重影响，而迄今为止还没有彻底治愈IBD的方法，这使得广大学者都在寻求一种新的治疗途径，其中干细胞移植给IBD的临床治疗带来了全新的思路。

1 干细胞

干细胞具有细胞不对称分裂、自我更新、多向分化的特性。胚胎干细胞是多潜能细胞，在体内和体外均具有从3胚层中塑形组织的能力。在不同培养基和生长因子的培养条件下，胚胎干细胞的能力在培养和分化过程中也被扩展至特殊的表型，这也是使细胞疗法独具魅力的起源。诱导的多能干细胞可以从成体细胞中获取，在培养物中迫使其成为类胚胎干细胞样状态。类胚胎干细胞和诱导多能干细胞在特殊培养条件下，可以直接转化为其他的表型。诱导的多能干细胞不是从胚胎中获取的，要避免与人类胚胎相关的伦理问题产生。未分化的胚胎干细胞和诱导多能干细胞在移植后均能引起胚胎瘤，因此，当胚胎干细胞和诱导多能干细胞用于产生分化细胞时，完全消灭未分化细胞是临床应用细胞疗法的关键一步。相反，成熟干细胞是从发育成熟的器官中分离出来的，而且在分化潜能方面与胚胎干细胞和诱导多能干细胞相比也更有限。因此，成熟干细胞被认为是多能祖细胞。最被认知的成熟干细胞就是造血干细胞，它可以从骨髓中浓缩或者是从外周血中收集。在移植入适当的受体者体内后，造血干细胞就会重组和修复所有成熟的血系。骨髓干细胞移植治疗淋巴瘤和其他的血液疾病已被人们所接受［2］。而对于面临着其他难治的和致命的血液疾病，骨髓移植的风险相比感染、出血和移植物抗宿主病还是有优势的。间充质干细胞是成熟干细胞的一个完全不同的种类，间充质干细胞可以从骨髓、软骨和脂肪中得来［3］。间充质干细胞在脂肪、软骨和骨这类中胚层组织中的分化潜能可能更受限制。移植间充质干细胞并不重组造血细胞系，但是却改变了宿主的免疫应答。

2 干细胞与IBD的关系

2.1 IBD的治疗研究现状 IBD可被认为是自身免疫性疾病，由消化道中不适当的免疫反应抵抗自身组织引起。主要的临床治疗就是联合应用如5-氨基水杨酸的抗炎药和免疫抑制剂，包括像皮质类固醇和免疫抑制剂类的硫唑嘌呤。新的药物，包括像抗肿瘤坏死因子和α-4整合蛋白，这些药物更适用于应用标准的免疫抑制剂后无缓解的患者。尽管有这些治疗措施，但是IBD的死亡率仍很高。糖皮质激素对于维持IBD的持续缓解并不十分有效，而且会引起众所周知的负面效应，这样就需求新的治疗途径。

近些年的研究表明，免疫系统的失调在IBD的发病机理中扮演主要角色。复杂的基因组联合研究涉及到一系列细胞活素类和它们受体的信号传导［4］。包括像基因编码 NOD2/CARD15、IL23R、TNFSF15［5-6］和IL-10R［7］中的变异体这样的报道。在无菌条件下培养的遗传易感性小鼠不易得病，表明了腔内菌群的必要性。经典实验表明IBD可以通过继承性转移致病T细胞而在小鼠体内传输。在易感宿主体内，对黏膜菌群的免疫应答的不当和延长，可由调控T细胞限制自身受体T细胞活性的失活而导致［8］。当骨髓从IL-10敲除的小鼠体内移植入野生型受体体内时，并不转移IBD，在IL-10敲除的小鼠体内移植入正常的骨髓后，结肠炎得到显著改善。在IL-10缺乏的小鼠体内移植正常骨髓后，结肠炎得到改善，但主要归因于受体衍生上皮下肌纤维母细胞的移入［9］。曾有案例报道了人类可能过继性转移IBD，这例女性患者是因霍奇金淋巴瘤而接受了骨髓移植治疗，尽管她先前没有IBD的病史，但是却在同种移植骨髓干细胞后6个月发生了严重的爆发性Crohn’s结肠炎。而干细胞的供体者并没有个人或家族性的IBD病史，基因分析表明供体者而不是受体者，在NOD2/CARD15基因上携带CD相关的多态性。供体者和受体者在IBD3基因位点上都有很多的HLA级Ⅲ单元的错配［10］。病人在长期的非IBD免疫条件下，应用了自体或异体造血干细胞移植来治疗无相关性的恶性肿瘤，后来有了显著好转，这些意外的收获致使造血干细胞移植成为了补救治疗，治疗标准免疫抑制剂治疗耐受的免疫疾病［11］。与此相同，因其他原因而进行骨髓移植的病人中IBD意外得到缓解，这也致使骨髓移植治疗 IBD成为了新的策略。

2.2 骨髓干细胞移植治疗IBD的可能机制 干细胞根据发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞、肠道干细胞等［12］。肠道上皮干细胞具有持续更新与分裂增殖能力，能修复受损肠道黏膜并恢复正常功能，因此骨髓干细胞移植增强了肠道上皮修复能力。另外，干细胞可能调节肠道免疫，目前认为间充质干细胞移植可分化为具有功能的间质和非间质细胞来修复受损组织;其次，它具有免疫抑制能力，可抑制T、B淋巴细胞的活化，降低树突状细胞抗原呈递作用和它们的功能［13］。

2.3 IBD的两个干细胞移植治疗方法

2.3.1 自体骨髓干细胞移植:在自体造血干细胞移植后，IBD得到缓解的第1例报道是一位41岁的女性患者。有20多年的CD造瘘史的非霍奇金淋巴瘤患者。她的非霍奇金淋巴瘤由化疗和自体骨髓干细胞移植来治疗。骨髓移植6个月后，淋巴瘤症状得到缓解，而CD症状也是在这么多年来第一次得到缓解。推测CD得到改善归因于骨髓移植，而且推断CD不是自体骨髓移植的绝对禁忌证［14］。更多的无对照研究报道了患者IBD得到临床意义上的缓解，这些患者是接受化疗和自体骨髓干细胞治疗同时伴发恶性肿瘤的。基于应用干细胞动员、原始粒细胞和自体干细胞治疗有CD和恶性肿瘤的患者的成功，这种方法已尝试作为无恶性肿瘤患者IBD的补救治疗。那些研究报道中的患者有活跃的，难治的，伴有并发症的CD。Oyama等［15］报道12例患者中有11例达到临床缓解，与此同时，Cassinotti等［16］报道4例患者中有3例达到临床缓解。这种方法有效地使免疫抑制作用发挥显著，使自体淋巴细胞和骨髓细胞增多。这一方法的有效性与T细胞活性失调抵抗黏膜自身抗原的模型是一致的，这正是在IBD的发病机理中所扮演的主要角色。自体骨髓干细胞移植后复发疾病的缺乏表明，促炎T细胞反应的阻断可充分打破自身反应性的非适应性循环。然而，报道的病例数非常小而且无对照。这一方法的成功可能因报道的偏倚而被估计过高，因为治疗学不足和治疗相关不利事件很少被报道。1例自体骨髓干细胞移植治疗非霍奇金淋巴瘤的患者，CD得到缓解后8年又出现了再复发，可见长期的随访也很有必要［17］。尽管有这些限制，在一组即使最有效治疗方案下也耐受的患者中，他们的临床缓解还是很令人惊叹的。尽管有发病率和间期败血症、出血的死亡率的风险，原粒细胞和自体造血重建还是非常显著的，而对于这些常规治疗失败并且愿意接受自体骨髓移植的病人来说，一个谨慎的计划、前瞻性的临床试验还是应该有所保证的。

2.3.2 同种异体干细胞移植:Lopez-Cubero等［18］报道了6例接受同种异体骨髓干细胞移植治疗的并发CML或AML的CD患者，所有患者都进行了白血病的多种药物联合化疗。移植条件包括环磷酸铵和总体照射。同种异体移植的供体细胞是所有HLA匹配者，而不是T细胞缺乏。CD的活动度不能用于移植97天后死于败血症的AML患者的评估。在5例幸存者中，有4例患者在随后的4～15年其CD症状得到了缓解。这4例患者皮肤和(或)肝脏的急性和慢性抗宿主反应都做了记录。Ditschkowski等［19］做了一项关于因AML、CML和白血病接受同种异体骨髓干细胞移植7例CD患者和4例UC患者的回顾性观察。5例CD患者有肠瘘或肠道狭窄史。在BTM之前，5例患者有不活跃的肠道炎症，另外6例在症状、内窥镜观察或组织学有轻度或低活跃肠道炎症。化疗、供体骨髓条件、移植方案具有多样性。1例患者在移植半年内死于肺部真菌感染，存活的10例患者除1例有轻度CD外，其余9例患者在平均34个月内(3～117个月)肠道炎症得到了缓解。8例患者有1或2级抗宿主反应，并应用激素后得到了控制。没有患者发展为严重或慢性抗宿主反应。最近的报道指出早期急性小肠结肠炎患者IL10-RA和IL-10RB的基因失活，1例IL-10RB基因突变的患者患有标准疗法难治的肠瘘，他接受HLP匹配的无IL-10RB基因突变的供体进行了骨髓移植治疗。他得到了供体全部的造血功能的嵌合，而且他在激素治疗后移植抗宿主反应轻微。移植后1年多，他的肠道炎症完全得到了控制。在这个病例中，有基因突变潜在的IBD很易鉴别，且自体移植无效。没有基因突变的HLA匹配的兄弟姐妹捐赠者是可以的，所以同种异体移植是符合伦理道德的，并且具有实用性。由于相比自体移植，同种异体干细胞移植后受体的移植相关并发症的发病率更高，所以，目前尚没有肠道炎症的同种异体骨髓干细胞移植的临床前瞻性研究。

3 移植的间充质干细胞在体内的命运

全身输入的间充质干细胞将移行至损伤和炎症部位。间充质干细胞自己找到路的机理尚不完全清楚，可能在不同组织中涉及到化学增活素和他们的受体的交互作用［20-21］。干细胞治疗的目标需要了解移植细胞的命运，这依靠于给药的剂量和途径。如果间充质干细胞可以归巢到受损组织，则全身给药即可。若为达到疗效而需求高水平的组织移植物移入，则应局部给药。为了研究这一问题，在标记的同系基因型的大鼠骨髓间充质干细胞在培养基中传代，通过动脉、静脉，或者是腹腔注射传到普通大鼠体内然后做全身伽马成像。给药后立即追踪主要集中在肺和肝。48 h后主要追踪到肝［22］，这一方法的主要限制是个体器官检查不够详尽，并且活供体细胞和正被清除的死细胞碎片无法区别开来。另一方法是监督1周后骨髓干细胞转运，就是用铁粒子在培养基中标记细胞，然后用核磁共振检测它们在体内的分布。用这一方法，单个骨髓干细胞可以在脾注射后在肝脏中通过核磁被检测出来。

4 干细胞治疗IBD可能的危险和需要解决的问题

4.1 干细胞治疗的风险 自体或者同种异体造血干细胞移植的风险已经众所周知，包括出血、败血症和移植物抗宿主疾病。产生临床等级的人干细胞用于治疗也需要严格排除感染细菌和病毒疾病。与造血细胞不同的是，骨髓干细胞必须在良好的培养条件下培养，并严格控制质量。在已经发表的文章里，人干细胞来自自身供体或者正常的同种异体供体。感染疾病或者恶性病用自体干细胞治疗的风险应该是比较低的。用同基因的造血或者器官移植，也有一个小的风险，即恶性病从供体转移到受体。干细胞本身可能产生肿瘤，尽管这方面的证据有限。在一篇报道中，为了追踪细胞使用编码萤火虫荧光素酶或者DsRed2的非病毒载体进行鼠骨髓干细胞移植，一同输入受辐射的受体。意外的是，几个发展成肉瘤的鼠干细胞来源于肺或者是肢体末端［23］。这些报道提示干细胞来源的肿瘤形成可能是一个隐患，而且最好避免干细胞的长期培养。同种异体干细胞对移植物抗宿主病的抑制，可能同时降低移植物抗肿瘤反应，因此有必要随访用干细胞治疗的患者血液病的长期发生率。

4.2 干细胞治疗面对的问题 干细胞移植治疗最佳时机的选择;移植适应证的选择;合理的预处理方案;自体移植物去除T淋巴细胞的利弊;如何进行个体化治疗;并发症的防治;移植后激素减量的方法;移植后免疫重建的研究;干细胞移植后在体内的转化过程及机制［24］;如何进一步提高移植成功率等都是未来研究的方向等。

5 总结

自体或者异体骨髓移植治疗难治性IBD仍然是实验性的。这个方法应该限制给严重疾病的患者用，最好在恰当的临床试验设计情况下执行。全身的免疫调节干细胞治疗不用在受体内长期植入，也不需要额外的免疫抑制。全身干细胞治疗能否长期缓解IBD仍需要临床试验来验证。一期和二期研究还没有关注安全性，尤其对于肿瘤的形成。对于临床难治的CD瘘，局部应用干细胞来提高其治愈率可能是很有效的方法，但也需要在临床试验中作进一步研究。随着技术的创新，治疗经验的丰富，会有更多患者得到更好的救治，干细胞移植治疗在IBD中的应用将仍是消化系疾病的热点，相信不远的将来应用干细胞移植治疗IBD将会成为必然趋势。

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