干细胞移植治疗食管放射性损伤的研究进展

仝甲钊，曲 波，金世柱

哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科，黑龙江哈尔滨150086

长期以来，食管放射性损伤是头、颈及胸部恶性肿瘤放射治疗的重要并发症之一［1］。目前临床上主要采取对症支持治疗，此类方法虽可有效缓解部分症状，但其远期疗效欠佳，不良反应亦较为明显［2］，尤其对晚期放射性食管损伤本身的病变来说并无有效的帮助。因此如何使严重损伤的食管上皮重新修复，并恢复功能，避免形成狭窄，一直是亟待解决的难题。过去的研究主要集中在止痛解痉、抗菌消炎、保护消化道黏膜的对症处理上［1］，而这些方法并不能从根本上解决问题。如今，干细胞移植治疗组织器官损伤的研究方兴正艾，并已取得良好的成效，因此应用干细胞移植治疗食管放射性损伤为我们指出了一个新的研究方向。

1 干细胞移植治疗食管放射性损伤的理论基础

1.1 干细胞的特性及分类 干细胞是一类未充分分化的多潜能细胞，它不仅能自我更新，而且在一定条件下能诱导分化为多种成熟功能细胞［3］。通过干细胞的分化能力可以把其分为如胚胎细胞类的全能干细胞、三种胚层细胞类的多能干细胞、仅能分化为一种特定细胞类型，也叫做受约束的祖细胞的单能干细胞［4］。虽然胚胎干细胞具有分化的全能性，但由于存在伦理学、免疫排斥以及潜在的致瘤性等问题限制了它在临床上的应用。所以，干细胞治疗放射性食管损伤的研究主要集中在食管上皮干细胞、骨髓源性干细胞等成体干细胞。

1.2 骨髓中存在的两个独特的干细胞群 在骨髓中存在着多种类型的细胞，包括成熟血细胞和少量的干细胞。骨髓干细胞［5］具有自我更新能力强，长期保持活性及多向分化的潜能，被称“可塑性”。当机体处于生理或者病理情况下，可动员骨髓干细胞释放入周围循环中而参与多种组织的再生。骨髓干细胞主要包括造血干细胞、骨髓间充质干细胞。造血干细胞在体内主要分化成红粒、单核系统，其功能主要维持体内造血功能，在血液系统疾病方面研究较多，并已取得很大进步。骨髓间充质干细胞是骨髓中的主要支持细胞，其功能包括:通过分泌骨髓基质，提供造血微环境;具有在一定的环境和诱导因子作用下，分化为肝脏、心肌、肌腱、成骨、脂肪、软骨、血管内皮等成熟细胞的能力［6］。

2 受辐射器官组织修复中的骨髓干细胞动员

2.1 骨髓干细胞在经射线照射后的动物体内的迁移分化 造血干细胞和间充质干细胞都能通过体液循环进行迁移，并在特定的情况下显示出增强的动员及转移到远组织位点的能力［7］。未受照射的骨髓区域能够动员造血干细胞，随后使之循环聚集，并使它们在受过照射或损伤的区域归巢和重新增殖。Quesenberry等［8］通过对小鼠进行全身照射，破坏其造血系统，而仅屏蔽它的一个肢体，结果证明能使其造血系统完全重建和恢复。骨髓间充质干细胞［9］也可以从未受照射的区域迁移到遭受严重辐射位点，同时也有助于晚期的辐射损伤纤维化的修复，并具有显著改善肺泡间隔纤维化损伤的功能。

2.2 骨髓干细胞的动员刺激因素 造血干细胞和间充质干细胞群的调动受多种因素的刺激，包括细胞因子，以及涉及到辐射旁观者效应的某种未知的可溶性因子［10］。通常人们认为，为身体某部位照X光时所佩带的防护铅板能够保护身体的其他部位免遭辐射。然而根据研究，在将培养液中的细胞暴露在电离辐射下后，即便是那些没有经过直接照射的细胞的染色体也会受到损伤。显然，一些经过照射的细胞传递了一个恶化的信号，或者释放了一些化学物质，从而破坏了周围细胞的脱氧核糖核酸，这种现象即称为辐射旁观者效应。集落刺激因子和其他骨髓源性细胞因子也已经表现出能调动造血干细胞进入人和动物的外周血［8，11］。

2.3 骨髓起源细胞在组织修复中的作用 最新证据表明骨髓源性细胞群有助于恢复性组织及上皮组织辐射后晚期纤维化的修复［12-13］。骨髓干细胞遗传学标记已经被证明与一些细胞具有相同的表型标志物，这些细胞主要负责辐射后的肺［8］、食管和化学性毒物损伤性肝脏［14］的再生修复。骨髓源性细胞的循环聚集已经被认为参与脑、脊髓、皮肤以及其他器官的损伤修复，但目前尚不清楚骨髓起源细胞是否在遭受辐射的上皮组织中负责早期修复阶段。

3 干细胞移植治疗食管放射性损伤的基础研究

3.1 人类食管上皮的最初分化形成与造成放射性食管损伤的主要影响因素 食管代表了一种与皮肤鳞状上皮和消化道功能上皮相似的一种组织。在胚胎发育阶段，人类早期妊娠胎儿拥有了腺状形态上皮和肠上皮功能。在胎儿发育期间，开始出现了食管上皮到鳞状上皮的明显过度，并且在全部食管上拥有了天生的角化鳞状上皮。近年来，食管起源细胞重新增殖在食管放化疗损伤中的作用已经成为一个令人感兴趣的话题。随着放化疗药物包括卡铂、紫杉醇、依托泊苷和吉西他滨的出现，以及实施更先进的放射治疗方法，包括强度调控放射治疗，对肿瘤目标放射剂量逐渐增加，从而达到对食管来说有意义的放射剂量，严重放射性食管炎得到了广泛的报道［15］。目前，放射性食管炎仍然是非小细胞肺癌及食管癌放化疗的主要并发症，且常常由于脱水、食管溃疡限制既定方案的完成以及放疗剂量的增加［16-17］。

3.2 干细胞移植在食管放射性损伤模型中的应用研究 近年来，通过给予辐射损伤组织局部、静脉移植骨髓干细胞或相应组织的起源细胞从而使这些组织重新增殖修复的研究获得了极大的关注，同时也已经成为一个热门学科。

3.2.1 食管起源细胞表型分析与其在放射性食管损伤中的表达和分化:Epperly等［13］通过应用造血干细胞表面标志物 Sca-1、Thy-1、CD45或者 c-kit的 FITC、PE或PE-Cy5共轭抗体对食管鳞状细胞染色，断定食管起源细胞的表面和组织化学表型，从而对食管起源细胞的表达分化进行检测分析。然后通过Hoechst/碘化丙碇法和连续悬浮法两种方法从成年C57BL/6JGFP阳性小鼠中分离出非黏附、圆形食管祖细胞。用Hoechst/碘化丙碇法从每个食管中能够得到大约5×102～2×104个细胞，而用连续悬浮法则能得到8×103～5×104个细胞。然后把这些起源细胞通过静脉移植入GFP阴性、躯体上部受过照射的小鼠体内，在受体食管中检测GFP阳性细胞。结果得出在注射后第14天和21天的食管鳞状上皮层中检测到GFP阳性位点。

Kalabis等［18］验证了食管基底层干细胞的存在，他们应用Hoechst染色挤压和BrdU标记保留分析法鉴定得出在小鼠食管中存在着一个潜在的食管干细胞群，它定位于基底细胞特定区室，具有自我更新和分化为基底上层细胞，以及始终拥有与干细胞、起源细胞相似的能力。

3.2.2 骨髓源性细胞在放射性食管损伤中的表达和分化及其他应用:Epperly等［13］用30 Gy量的射线照射C57BL/6J雌性小鼠躯干上部中位，从而造成放射性食管炎，然后通过静脉注射入体内5×104～1×106个全骨髓细胞，对照组不予注射。结果显示给予每只小鼠1×106个全骨髓细胞能够使食管受30 Gy射线照射的小鼠免于致死性食管炎。结果还得出在单粒级高剂量照射的情况下，通过静脉注射骨髓细胞对放射性食管炎能够起到保护作用。

为了判定骨髓细胞是否能自然地迁移到放射损伤的食管处，使C57BL/6J雌性鼠接受10 Gy的整体照射和5×105个GFP阳性雄性骨髓细胞静脉移植，在移植30天后，从受移植鼠身上取外周血检测，那些表达超过50%GFP阳性循环有核细胞的小鼠被认为成功嵌合。然后使这些鼠身体上部接受30 Gy剂量的射线照射，结果显示出外源骨髓细胞的迁移和归巢，并在21天后形成食管焦点，并清楚地显示GFP和Y染色体阳性。未受照射的小鼠食管不显示GFP阳性。这些资料表明骨髓细胞在受过照射的食管中具有一定程度归巢、增生并形成集落的能力。

Sarosi等［19］在进行骨髓源性细胞与大鼠 Barrett食管修复及化生关系的研究中，从雄性大鼠四肢胫骨和股骨中提取骨髓细胞，分离培养后经尾静脉注入已受致死性射线剂量照射的雌性大鼠体内，从而使大鼠骨髓和免疫系统得以重建，然后通过既定手术造成反流性食管黏膜损伤。结果显示，在Barrett食管上皮中能够发现由骨髓源性细胞分化而来的食管黏膜鳞状上皮细胞，并排除其他可能混淆因素。这些结果也表明在食管损伤病理情况下，通过注射外源干细胞，能够起到食管损伤修复的作用。通过这些研究，我们也可以得出外源干细胞移植不仅能够对食管放射性损伤进行修复，且对食管黏膜的多种损伤都可能有修复作用。

4 目前骨髓干细胞治疗食管损伤存在的问题与前景

在过去的十几年中，干细胞的研究已经取得了极大的进展。越来越多的研究显示出干细胞对损伤组织包括胃肠道拥有非常大的治疗潜能。然而就食管损伤模型来说，骨髓细胞是否能自然地循环到食管损伤区域并重建它，作为一种自我平衡机制或者对损伤的反应，依然是一个未知数［13］。且目前应用干细胞移植治疗食管放射性损伤的研究过少，且多数研究的干细胞选取仅局限于组织本身的基底细胞和全骨髓细胞［13，19］，因此在放射性损伤生物学研究方面，干细胞真正应用于临床还有很多问题需要解决，如移植干细胞的选择、移植后的远期效果观察，特别是移植后的干细胞分化为肿瘤细胞的可能性［20］等方面，均需要大样本的资料来回答。不过目前的资料显示外源骨髓干细胞和食管基底细胞能够在受照射成年鼠食管的黏膜上皮表达分化。因此在不久的将来干细胞可能为上消化道损伤的治疗与食管获得性疾病提供一个有用的细胞资源。

［1］Gong LY，Ma SL.The research advance of Chinese and western medicine in radioactive esophageal injury［J］.Modern Journal of Integrated TraditionalChineseand Western Medicine， 2009，18(33):4164-4167.龚黎燕，马胜林.放射性食管损伤的中西医研究进展［J］.现代中西医结合杂志，2009，18(33):4164-4167.

［2］Zhang ZR，Wang FW.The therapeutic progress of Chinese and western medicine in radioactive esophagitis［J］.Chinese Journal of Information on TCM，2010，17(3):102-103.张柱仁，王发渭.放射性食管炎中西医治疗进展［J］.中国中医药信息杂志，2010，17(3):102-103.

［3］Blau HM，Brazelton TR，Weimann JM.The evolving concept of a stem cell:entity or function ［J］.Cell，2001，105(7):829-841.

［4］Alison MR，Poulsom R，Forbes S，et al.An introduction to stem cells［J］.J Pathol，2002，197(4):419-423.

［5］Xing NN，Li XS.Basic and clinical research of autologous bone marrow stem cells in treatment of hepatic cirrhosis［J］.Journal of Clinical RehabilitativeTissue Engineering Research， 2011， 15(36):6821-6824.邢旎旎，李孝生.自体骨髓干细胞治疗肝硬化基础研究与临床应用现状［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15(36):6821-6824.

［6］Gimble JM，Guilak F，Nuttall ME，et al.In vitro differentiation potential of mesenchymal stem cells［J］.Transfus Med Hemoth，2008，35(3):228-238.

［7］Epperly MW，Sikora CA，Defilippi S，et al.Bone marrow origin of myofibroblasts in irradiation pulmonary fibrosis［J］.Resp Am J Mol Cell Biol，2003，29(2):213-224.

［8］Quesenberry PJ，Colvin G，Abedi M.Perspective:fundamental and clinical concepts on stem cell homing and engraftment:A journey to niches and beyond ［J］.Exp Hematol，2005，33(1):9-19.

［9］Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissue［J］.Science，1997，276(5309):71-74.

［10］Blau HM，Brazelton TR，Weimann JM.The evolving concept of a stem cell:entity or function ［J］.Cell，2001，105(7):829-841.

［11］Ahmed F，Ings SJ，Pizzey AR，et al.Impaired bone marrow homing of cytokine-activated CD34+cells in the Nod/SCID model［J］.Blood，2004，103(6):2074-2084.

［12］Krause D，Theise N，Collector M，et al.Multi-organ，multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell［J］.Cell，2001，105(3):369-377.

［13］Epperly MW，Guo HL，Shen HM，et al.Bone marrow origin of cells with capacity for homing and differentiation to esophageal squamous epithelium［J］.Radiat Res，2004，162(3):233-240.

［14］Epperly MW，Sikora C，Defilippi S，et al.Manganese superoxide dismutase(SOD2)inhibits radiation-induced apoptosis by stabilization of the mitochondrial membrane［J］.Radiat Res，2002，157(5):568-577.

［15］Bhatnagar A，Flickinger JC，Bahri S，et al.Update on results of multifield conformal radiation therapy of non-small-cell lung cancer using multileaf collimated beams［J］.Clin Lung Cancer，2002，3(4):259-264.

［16］Epperly MW，Shen H，Jefferson M，et al.In Vitro differentiation capacity of esophageal progenitor cells with capacity for homing and repopulation of the ionizing irradiation-damaged esophagus［J］.In Vivo，2004，18(6):675-685.

［17］Movsas B，Moughan J，Sarna L，et al.Quality of life supersedes the classic prognosticators for long-term survival in locally advanced nonsmall cell lung cancer:An analysis of RTOG 9801 ［J］.J Clin Oncol，2009，27(34):5816-5821.

［18］Kalabis J，Oyama K，Takaomi T，et al.A subpopulation of mouse esophageal basal cells has properties of stem cells with the capacity for self-renewal and lineage specification［J］.J Clin Invest，2008，118(12):3860-3869.

［19］Sarosi G，Brown G，Jaiswal K，et al.Bone marrow progenitor cells contribute to esophageal regeneration and metaplasia in a rat model of Barrett’s esophagus［J］.Dis Esophagus，2008，21(1):43-50.

［20］Hutchinson L，Stenstrom B，Chen D，et al.Human Barrett’s adenocarcinoma of the esophagus，associated myofibroblasts，and endothelium can arise from bone marrow-derived cells after allogeneic stem cell transplant［J］.Stem Cells Dev，2011，20(1):11-17.