咪喹莫特对尖锐湿疣患者外周血白细胞介素-18表达的影响

夏卫中，李爱萍，张 峰，王翠媚

尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒感染引起的生殖器等部位皮肤黏膜良性增生性疾病，是一种国内目前最常见的性传播疾病之一［1］。白细胞介素18(IL-18)，也称干扰素γ(IFN-γ)诱导因子，是近年发现的细胞因子，在激活T细胞介导免疫和清除入侵微生物中起着关键作用［2］，而且也是一个能够在不同的免疫环境中调节Thl或Th2类免疫应答的细胞因子［3］。咪喹莫特膏是一种新型的小分子免疫调节剂，外用治疗尖锐湿疣具有明显的疗效［4］，但其治疗作用机制尚未明确。本文对咪喹莫特对尖锐湿疣患者外周血IL-18表达影响进行了探讨，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 资料 患者组22例为我院2009年11月～2010年3月的门诊患者，其中男12例，女10例，年龄16～36岁，平均年龄24.6岁，病程3 d～2个月。均符合尖锐湿疣诊断标准［1］。无合并其他性传播疾病或其他自身免疫性疾病，患者入选前2个月内无系统性应用免疫抑制剂或皮质类固醇制剂或抗生素或中药制剂。所有患者外用5%咪喹莫特软膏，8 h后用清水清洗患处，去除药物，隔日用药1次，疗程8周。患者治疗前后收集外周血4 m l。另选择20名健康者外周血作对照组，其中男10例，女10例，年龄16～36岁，平均年龄25.3岁。

1.2 方法 (1)外周血单-核细胞的分离:患者及健康对照者外周静脉血4 m l，加入EDTA抗凝管，PBS(pH7.4)等倍稀释;吸取淋巴细胞分离液2～15 ml离心管中，将稀释血液缓慢加入到分层液上，将离心管置离心机内，20℃，2 000 r/min，20 min，用毛细吸管吸取单个核细胞层，盛于另1支离心管中，用5倍体积的PBS洗2次，3 000 r/min，5 min，完全PRMI-1640定容细胞，调整细胞浓度至为5X106/m l。(2)外周血单-核细胞总RNA的提取:用Trizol－氯仿－异丙醇－乙醇法提取PBMCs总RNA。(3)引物的设计和合成:参考16sRND基因文库设计引物，IL-18引物序列如下:FO:5’-ACCAGTAGAAGACAATTGCATCAACT-3’，RO:5’–CCAGGTTTTCATCATCTTCAGCTA－3’，引物扩增片断长度为130bp，TaqMan Probe:5’-TGTGGCAATGAAATTTATTGACAATACGCTTTACTT-3’，由ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成。(4)逆转录反应:取4μl RNA模板作逆转录反应(PE9700PCR仪)，反应体系如下:5×逆转录buffer 4μl，上游引物(10 pM/μl)0.4μl，下游引物(10 pM/μl)0.4μl，dNTPs(25mM)0.2μl，MMLV(10 U/ μl)1μl，DEPC水10μl，总体积20μl。反应条件:37℃1 h，然后95℃3 min。(5)荧光定量PCR反应体系(荧光定量仪PE7000型PCR扩增仪扩增完成):反应体积为50μl，反应体系:5×定量PCR buffer 10μl，上游引物F1μl，下游引物R1μl，dNTPs0.5μl，荧光探针1μl，Taq酶1.5μl，cDNA 5μl，ddH2O 30μl。反应条件为:93℃ 2 min，然后93℃45 s，55℃45 s，共36个循环。反应结束后，计算待测样本IL-18 mRNA表达量(copy/μg RNA)。

1.3 统计学方法 采用SAS 8.01 for Window统计软件进行统计分析，组间比较采用秩和检验。

2 结果

IL-18mRNA的表达量IL-18mRNA在尖锐湿疣外周血中治疗前的表达水平明显高于健康对照组的表达水平(t= 10.82，P＜0.001);治疗后的表达水平分别明显低于治疗前的表达水平(t=10.74，P＜0.001);治疗后的表达水平与正常对照者的表达水平无明显差异(t=1.05，P＞0.05);见表1。

3 讨论

表1 患者和健康对照者外周血IL-18mRNA表达(±s，拷贝/μg RNA)

表1 患者和健康对照者外周血IL-18mRNA表达(±s，拷贝/μg RNA)

组别 例数IL-18患者组: 20 22393.79±5406.89治疗前 22 104942.32±22694.05治疗后 22 30332.51±18674.39对照组:

IL-18具有多种生物学活性，主要由活化的巨噬细胞产生，也可由上皮细胞包括角朊细胞产生。研究表明，IL-18可激活T细胞和外周血单核细胞产生大量的干扰素γ，促进Thl类细胞因子的产生，增强NK细胞和T细胞的细胞毒性，从而增强宿主抗肿瘤及病原微生物感染的作用［5-6］。动物感染模型的研究提示IL-18可通过诱导IFN-γ产生而发挥其清除病原微生物的功能［7-8］。本研究结果显示尖锐湿疣患者皮损和健康者皮肤均有IL-18 mRNA的表达，但尖锐湿疣患者的表达量明显高于健康对照者，与刘国英等［9］报道的基本一致。提示在人类乳头瘤病毒感染时，机体的抗感染免疫有一定的激活，产生IL-18抗病毒因子，这可能与病毒最终被清除有一定关系。

咪喹莫特属于免疫调节剂，是一种干扰素诱导剂。咪喹莫特虽然对于病原微生物和肿瘤细胞无直接的杀伤作用，但因在用药局部诱导产生炎症反应和多种细胞因子，进而增强机体的细胞免疫活性与免疫应答，通过免疫调节发挥间接抗病毒作用［10］。有研究表明，5%咪喹莫特治疗肛周和外生殖器疣疗效好，安全性好，使用方便［10］，但其治疗尖锐湿疣的作用机制的研究甚少。最近的研究认为咪喹莫特治疗后尖锐湿疣患者体内IL-2表达水平较治疗前上升，IL-10表达水平较治疗前下降，提示咪喹莫特有可能通过免疫调节作用，部分纠正Th1/Th2比例失衡，改善机体的免疫功能，增强抗病毒能力［11］。本研究发现患者外周血中IL-18的表达明显高于健康对照者的表达水平，患者经过咪喹莫特治疗后，皮损消退，IL-18的表达降低。这些结果提示咪喹莫特能抑制尖锐湿疣患者外周血IL-18的表达，恢复患者血液IL-18表达平衡，这可能是咪喹莫特治疗尖锐湿疣的作用机制之一。

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