超声波辅助提取桔梗皂苷方法的研究

王 鑫，徐丽萍，张海华

(哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨150076)

桔梗属于大宗药材品种，形似人参，药食两用，素有“南方人参”的美誉.桔梗不仅是一种传统中药［1］，还是一种食品，其中含有多种氨基酸，以及钙、镁、铁、锌、锰、铜、铅、磷等人体必需微量元素，此外桔梗中还含有大量亚油酸等不饱和脂肪酸、多聚糖、无机盐、甾体类化合物等［2］.桔梗中含有的大量亚油酸等不饱和脂肪酸，具有降压降脂、抗动脉粥样硬化等多种作用，由此可见桔梗是一种很好的功能性食品.桔梗的主要活性成分为桔梗皂苷(platycodin，PD)，桔梗中三萜皂苷经近几年来的研究，已证明它在养禽业上具有重要的作用.三萜皂苷类有精神安定、放松肌肉和降温的作用.还具有抗癌、抗肿瘤作用，可抑制癌细胞的增长，对消化系统尤其是胃癌效果明显［3］.

1 材料与方法

1.1 实验材料

桔梗，市售.

1.2 主要试剂与仪器

无水乙醇(天津市天新精细化工开发中心);正丁醇(天津市博边化工有限公司);浓硫酸(哈尔滨市新达化工厂);氢氧化钠(天津市化学试剂三厂);盐酸(天津市天新精细化工开发中心);三氯醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司);旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司);双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 醇提法提取桔梗皂苷

将桔梗用烘箱烘干，用搅碎器搅碎.取10.00 g桔梗碎末放入锥形瓶中，加入95%的乙醇100 mL，振摇后在常温下静置1.5 h进行皂苷的提取，对提取液进行过滤，弃去滤渣，将滤液用旋转蒸发器进行浓缩至1/3，得到的褐色黏稠液体再加入50 mL水饱和正丁醇进行萃取，取上清液至旋转蒸发器浓缩并对水饱和正丁醇进行回收，将得到的淡黄色固体放入电热恒温干燥箱中在60～70℃下干燥至恒重，计算桔梗皂苷的提取率［4］.

1.3.2 超声波辅助提取桔梗皂苷单因素的选择

以桔梗皂苷提取率为指标，对比分析热提法、冷浸法、醇提法，选出桔梗皂苷提取率较高的提取方法.根据实验条件和相关文献确定影响提取效果的因素，如乙醇体积分数、料液比、超声温度及超声时间等.为了确定实验中各因素对桔梗皂苷提取率的影响，进行单因素实验.即改变某一条件，固定其他条件，测定桔梗皂苷提取率［5］.

1)乙醇体积分数单因素实验

称取5份等量的桔梗粉末，每份10.00 g于锥形瓶中，采用乙醇作为提取溶剂，分别选取乙醇体积分数为60%、70%、80%、90%、100%，在料液比1∶10，温度40℃，超声震荡30 min条件下提取桔梗皂苷.以提取率为指标，考察乙醇体积分数对提取率的影响.

2)料液比单因素实验

称取5份等量的桔梗粉末，每份10.00 g于锥形瓶中，采用体积分数90%乙醇作为提取溶剂，物料与溶剂之比分别为1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12，在温度40℃，超声震荡30 min条件下提取桔梗皂苷.以提取率为指标，考察料液比对提取率的影响.

3)超声温度单因素实验

称取5份等量的桔梗粉末，每份10.00 g于锥形瓶中，采用体积分数90%乙醇作为提取溶剂，按1∶10料液比，超声震荡30 min条件下分别在25、30、35、40、45℃提取桔梗皂苷.以提取率为指标，考察超声温度对提取率的影响.

4)超声时间单因素实验

称取5份等量的桔梗粉末，每份10.00 g于锥形瓶中，采用90%乙醇作为提取溶剂，按1∶10料液比，温度40℃条件下分别超声震荡20、30、40、50、60 min提取桔梗皂苷.以提取率为指标，考察超声时间对提取率的影响.

1.3.3 超声波辅助提取桔梗皂苷最佳条件的选择

根据单因素实验的结果，选择影响提取效果的4个主要因素:乙醇体积分数(A)、料液比(B)、超声温度(C)和超声时间(D)，采用正交设计表L9(34)安排实验.因素水平表见表1.

表1 因素水平表

1.3.4 定性定量分析实验

1)桔梗皂苷提取率的测定

其中:m为桔梗皂苷质量，g;M为桔梗质量，g.

2)泡沫试验

取桔梗皂苷提取液10 mL于试管中强列振摇，观察其现象，记录泡沫持续时间.

取2支试管，分别加入0.1 mol/L盐酸液5 mL、0.1 mol/L氢氧化钠液5 mL，再各加入桔梗皂苷溶液，分别调整pH值为1、13，强烈振摇，观察其现象.如溶液pH分别为1、13，两支试管所形成的泡沫高度相同，则桔梗皂苷中含三萜皂苷，如pH为13的碱管泡沫较pH为1的酸管泡沫高数倍，则桔梗皂苷中含甾体皂苷(中性皂苷的水溶液在碱性溶液中可形成较稳定的泡沫，借此可与酸性皂苷区别).

3)三氯醋酸反应试验

皂苷与三氯醋酸试剂反应产生颜色变化，在60℃时能显红色－紫色变化的为甾体皂苷，在100℃时才出现红色－紫色的变化，为三萜皂苷［6］.将桔梗皂苷溶液滴在滤纸上，喷三氯醋酸试剂，加热，观察在不同温度下其颜色变化.

2 结果与讨论

2.1 醇提法提取桔梗皂苷结果与分析

从表2中可以看出，采用醇提法提取的桔梗皂苷提取率较高为3.17%.由此可见，不同的溶剂对浸提效果有显著的影响，采用乙醇作为提取溶剂桔梗皂苷提取率较高［7］.

表2 实验参数值

2.2 超声波辅助提取桔梗皂苷单因素结果与分析

通过对比桔梗皂苷提取率确定最佳提取方法为超声波辅助醇提法.选取影响超声波辅助醇提法效果的主要因素:乙醇体积分数、料液比、超声温度、超声时间，分别进行单因素实验，以桔梗皂苷提取率为指标，确定影响桔梗皂苷提取的，为正交试验提供依据.

2.2.1 乙醇体积分数单因素实验结果与分析

实验结果显示，随着乙醇体积分数的的升高桔梗皂苷提取率显著增加，当乙醇体积分数为90%时，桔梗皂苷提取率达到最高点，继续升高乙醇体积分数桔梗皂苷提取率呈下降趋势.因此，选定90 %的乙醇为最佳体积分数.由此看出，乙醇体积分数是提取过程中的一个重要因素.利用乙醇的溶解性，将乙醇作为溶剂对物质进行分离提纯，主要与其低碳直链醇的性质有关，分子中的羟基可以形成氢键，因此乙醇黏度很大，也不及相近相对分子质量的有机化合物极性大.见图1.

图1 乙醇体积分数对桔梗皂甙提取率的影响

2.2.2 料液比单因素实验结果与分析

实验结果显示，随着料液比的减少桔梗皂苷提取率显著增加，见图2.当料液比为1∶10时，桔梗皂苷提取率达到最高点，继续降低料液比桔梗皂苷提取率呈下降趋势.因此，选定1∶10的料液比为最佳比例.液料质量比是提取过程中的一个重要因素，从传质速率的角度讲，主要表现影响固相和液相主体之间的质量浓度差，即传质推动力.液料质量比小，提取过程中液相质量浓度增加快，两相间的质量浓度差减少加快，从而使传质推动力衰减加快.其次，液料质量比的大小会影响两相的混合情况，尤其在搅拌不充分的情况下，将改变传质系数，而影响传质速率.液料质量比的提高必然会在较大程度上提高传质推动力，但也提高了生产成本及后处理难度.

图2 料液比对桔梗总皂苷提取率的影响

2.2.3 超声温度单因素实验结果与分析

由图3可知，随着温度的升高，桔梗皂苷提取率增加，在超声温度为40℃时桔梗皂苷提取率达到最高点，超声温度继续升高时，桔梗皂苷提取率呈下降趋势.而且在长时间、温度较高的条件下，活性成分被破坏，综合考虑，确定超声温度为40℃为最佳温度.由此可以看出，超声温度对提取的皂苷提取率有一定的影响.通常来说温度升高，其渗透、溶解、扩散速度加快，所以提取效果较好，但温度过高也会使一些不耐热的成分破坏，同时杂质溶出量也随着增多.因此，超声温度要适宜.

图3 超声温度对桔梗总皂甙提取率的影响

2.2.4 超声时间单因素实验结果与分析

由图4可知，随着超声时间的延长桔梗皂苷提取率显著增加，在超声时间30 min时桔梗皂苷提取率达到最高点，继续延长时间，桔梗皂苷提取率呈下降趋势.因此，为获得较好的提取效率并考虑节约能源，确定超声时间为30 min.由此可以看出，超声时间对提取的皂苷提取率有一定的影响.但需要指出的是超声时间过长也可能使皂苷类成分生物活性受到破坏，有效成分不再被溶解，同时杂质溶出量也随之增多，因此，超声时间要适宜.

2.3 超声波辅助提取桔梗皂苷最佳条件结果与分析

通过正交实验确定最佳的提取方法，考察指标为桔梗皂苷提取率(%)，其实验结果见表3.

表3 正交试验结果表

图4 超声湿度对桔梗总皂甙提取率的影响

通过比较正交试验表中各因素的极差值(R)，可以看出，影响桔梗皂苷提取率因素顺序为A＞B＞C＞D，最佳提取条件为A2B3C3D2，即乙醇体积分数90%、料液比1∶11、超声温度45℃、超声时间30 min.通过验证试验，采用最佳工艺条件提取桔梗皂苷，提取率为4.255%.

2.4 定性定量分析实验结果与分析

2.4.1 泡沫试验结果分析

图5、6所示，桔梗皂苷溶液经振摇后产生持久性泡沫15 min以上(即为阳性反应)且2支试管产生泡沫的高度相同，由此可以证明桔梗皂苷中含有三萜皂苷.

2.4.2 三氯醋酸反应试验结果分析

桔梗皂苷在100℃显示红色－紫色，进一步证明其含有三萜类皂苷.

3 结语

采用桔梗为原料，以桔梗皂苷的提取率为指标，对超声波辅助提取桔梗皂苷的方法进行研究.以乙醇为主要提取溶剂，选择乙醇体积分数、料液比、超声温度和超声时间为影响因素提取桔梗皂苷，以桔梗皂苷提取率为指标，采用正交试验确定最佳提取方法，桔梗皂苷最佳提取条件为:乙醇体积分数90%、料液比1∶11、超声温度45℃、超声时间30 min，提取率为4.255%.通过泡沫试验和三氯醋酸反应试验判定从桔梗中所提物质为三萜皂苷.

［1］ 矫艳春.桔梗资源的开发与利用［M］.通化:吉林省通化市教育学院，2000.

［2］ 何美莲，程小卫，陈家宽，等.桔梗皂苷类成分及其质量分析［J］.中药新药与临床药理，2005，16(6):457.

［3］ 宋 杨，齐云.桔梗的药理研究进展［J］.中国药房，2006，17(2):140－141.

［4］ 李喜风，薛秋萍，藿诚明.桔梗中总皂苷的含量测定［J］.中医药学刊，2006，12(24):2232.

［5］ 吴玉兰，丁安伟，包贝华.炒酸枣仁中酸枣仁皂苷的提取纯化方法研究［J］.中药材，2005，28(3):219－223.

［6］ 钟露苗.三萜皂苷提取分离和结构鉴定技术［J］.中医药学刊，2004，22(4):760－762.

［7］ 徐丽萍，刑 超，王 鑫，等.酶解法制备大豆低聚肽工艺的研究［J］.哈尔滨商业大学学报:自然科学版，2012，28(2): 143－146.