犊牛大肠杆菌病病原的分离鉴定

尚婷婷，张耀相，林 青＊，朱 磊

（1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100，2.榆林市榆阳区青云乡畜牧兽医工作站，陕西榆林719000，3.榆林市榆阳区畜牧兽医局，陕西榆林719000）

犊牛大肠杆菌病是由致病性大肠埃希菌（也称大肠杆菌）引起的新生犊牛的一种急性传染病，因其主要临床症状是腹泻，排出灰白色稀便，故又称犊牛白痢。大肠埃希菌广泛地分布于自然界，动物出生后很短时间即可随乳汁或其他食物进入胃肠道，成为条件性致病菌，新生犊牛当其抵抗力降低或发生消化障碍时，既可引发该病。本病主要发生于10日龄以内的犊牛，特别是1日龄～3日龄的犊牛最易感。临床特征以急性腹泻、脱水和酸中毒为主，病犊多因腹泻、脱水、衰竭和酸中毒而死亡，也有表现败血症状的。病牛和带菌牛是最重要的传染来源，主要传播途径是消化道，子宫内感染和脐带感染也有发生。本病一年四季均可发生，但以冬春两季多见，有时呈地方性流行［1-3］。本病发病率和死亡率因有无继发和并发感染、饲养管理水平、环境卫生条件、采取措施是否及时有效而差异较大［4］。

2011年1～3月份，陕西省杨凌示范区某奶牛养殖场发生了新生犊牛以严重腹泻、脱水等临床症状的疾病，发病者多为生后1～3个月的犊牛，有的来不及用药即发生死亡，也有的犊牛用过多种药物，但治疗无效。经临床初步诊断为犊牛大肠埃希菌引起的腹泻病，笔者拟对发病犊牛进行致病性大肠埃希菌分离鉴定，并对分离菌进行药敏试验，为临床合理选择药物，有效防治犊牛大肠埃希菌性腹泻病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 普通肉汤、普通琼脂培养基、SS琼脂培养基、麦康凯琼脂培养、三糖铁琼脂斜面、伊红美蓝琼脂平板、MH培养基（药敏试验用培养基）等均按文献［5］的方法制备。4℃冰箱保存备用。

1.1.2 生化试剂与生化试验培养基 革兰染色液，各种糖发酵管，MR试剂，VP试剂，30mL／L H2O2，明胶溶液，硝酸盐还原试验用甲液和已液，柠檬酸盐试剂，吲哚试验试剂，4g／L酚红水溶液（三糖铁斜面、尿素培养基指示剂），10g／L溴麝香草酚蓝酒精溶液（柠檬酸盐培养基指示剂），16g／L溴甲酚紫酒精溶液（糖培养基指示剂），药敏片购于上海医华医学科技有限公司，批号20041116。

1.1.3 实验动物 昆明系小鼠21只，18g～22g，由西北农林科技大学动物医学院实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 无菌采集病料 将灭菌棉拭子在灭菌生理盐水中润湿，从杨凌某发病养牛场疑似细菌腹泻病发病犊牛的直肠内采取粪便样品，共5份，置4℃冰箱，待检。

1.2.2 细菌的分离培养 将采集到的粪便样品接种于普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板和鲜血琼脂平板，37℃培养24h。挑取血平板呈明显β溶血的中等大小光滑菌落，接种于普通肉汤增菌，置37℃温箱培养16h～18h，然后将培养物分别划线接种于麦康凯琼脂平板和鲜血琼脂平板进行细菌培养，24 h后挑取平板上可疑菌落抹片染色镜检。

1.2.3 可疑菌落的挑纯培养与菌种的保存 在经过37℃培养24h后，挑取麦康凯平板上的红色菌落以及血平板上有溶血现象的典型菌落涂片染色镜检。结果与先前所观察到的细菌进行比较后，如相同则挑取生长典型的菌落接种到普通琼脂斜面上进行纯培养（37℃，24h）；不同则重新接种培养。将经普通斜面培养基37℃，24h培养物置4℃冰箱保存，以便作进一步的鉴定。

1.2.4 生物学特性的观察 将分离到的纯培养物分别接种于普通肉汤培养基、普通平板、血平板、麦康凯平板、伊红美蓝琼脂以及SS琼脂培养基中，37℃培养24h，观察其生长表现。

1.2.5 生化试验 对挑纯的菌株分别进行糖发酵试验、MR、VP试验、接触酶试验、明胶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、三糖铁琼脂斜面试验、柠檬酸盐利用试验、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶试验、尿素酶试验等生化试验。培养48h～96h后观察结果。

1.2.6 抗生素敏感性试验 将大肠埃希菌纯培养物接种于营养肉汤，37℃培养24h，用灭菌生理盐水稀释使其浑浊度在所给比浊管范围之内。然后用灭菌棉签插入经稀释的普通肉汤培养物中，棉签沿管壁滚动，挤去多余液体，用含菌棉签从平板中央开始涂抹，然后再转90°涂布，使整个平板表面涂布上菌，再用灭菌镊子将含抗生素纸片放入平板内并压实，每个平板上放5个纸片，置37℃温箱培养24h后取出，测量抑菌环直径。

所用的药敏片有：氨苄青霉素、菌必治、氧氟沙星、妥布霉素、头孢呋肟、链霉素、利福平、先锋必、先锋噻肟、庆大霉素、环丙沙星、先锋V、苯唑青霉素、氯霉素、阿米卡星、头孢拉定、呋喃妥因、青霉素G、复方新诺明、氧哌嗪青霉素、卡那霉素、万古霉素、四环素、氟哌酸、复达欣、红霉素等。

结果判定标准：直径小于15mm为耐药，15 mm～20mm为中度敏感，大于20mm为高度敏感［5］。

1.2.7 动物致病性试验 取健康小鼠21只，随机分成两组，一组为试验组18只，另一组为对照组3只。试验组小鼠用一定浓度的肉汤纯培养物0.2mL进行腹腔注射，给对照组的小鼠用等量的灭菌普通肉汤腹腔注射。接种后进行隔离饲养。观察，记录小鼠的精神情况与死亡情况。

2 结果

2.1 分离菌在各种培养基的生长情况及分离菌的镜检特征

从所采集的5份病料中分离出6株菌，分别编号为SY1～SY6。所有分离菌在普通琼脂平板为中等大小、圆形凸起、边缘整齐、表面光滑湿润、半透明的灰白色菌落，直径约2mm～3mm；在绵羊血平板上生长良好，为中等大小圆形菌落，β溶血较明显；在麦康凯琼脂平板上为中等大小、圆形凸起、边缘整齐、表面光滑湿润的砖红色露滴样菌落；在伊红美蓝琼脂平板上形成黑色带金属闪光的圆形菌落；在SS琼脂培养基上不生长；普通肉汤培养基中呈均匀浑浊，有的管底有白色黏性沉淀。

所分离菌涂片在显微镜下可见革兰阴性、中等大小直杆菌，两端钝圆，成对或散在排列，无芽胞，有微荚膜，部分有两极着色现象。

根据以上特征，初步确定致病菌为肠杆菌科埃希菌属的大肠埃希菌。

2.2 生化鉴定结果

从生化试验结果可以看出，6株菌均符合大肠埃希菌的生化反应特性。分离的6株细菌都能发酵葡萄糖、麦芽糖和乳糖，并产酸产气，部分菌株不分解蔗糖；均不产生硫化氢，不分解尿素，不利用柠檬酸盐；硝酸盐还原试验阳性；吲哚和甲基红试验（MR）均为阳性，VP试验为阴性，由此可判定分离菌株为大肠埃希菌。

2.3 抗生素敏感性试验结果

该菌对菌必治、氧氟沙星、先锋必、先锋噻肟、环丙沙星、氯霉素、阿米卡星、卡那霉素、氟哌酸高度敏感；对妥布霉素、头孢呋肟、先锋V、头孢拉定、呋喃妥因中度敏感；对氨苄青霉素、链霉素、利福平、庆大霉素、苯唑青霉素、青霉素G、复方新诺明、氧哌嗪青霉素、万古霉素、四环素、复达欣、红霉素耐药。

2.4 动物致病性试验结果

经过24h后观察，注射了SY1、SY2、SY5和SY6肉汤纯培养物的小鼠均发病死亡，而注射了SY3和SY4肉汤纯培养物的小鼠发病但未死亡，对照组小鼠未见任何症状。死亡小鼠死前均可见精神萎靡、被毛蓬松、尾巴和腹部发钳、厌食、四肢僵直直至死亡。解剖死亡和发病未死亡的小鼠后发现，肺部有出血点，肝脏、脾脏有不同程度的水肿，通过病变组织抹片染色镜检后可以观察到与之前分离培养到的相同的细菌。无菌采取肝脏、脾脏病料，涂片，革兰染色、镜检，并进行细菌分离培养，所得结果与病料分离菌相同。

2.5 细菌分离鉴定结果

根据菌落的大小、形态、颜色、边缘状况、表面隆起度、透明度等，细菌染色后的特性、大小、形态、结合生化试验结果，通过查阅文献［6-11］，证实致病菌为肠杆菌科埃希菌属的大肠埃希菌。由此可以确定，该牛场犊牛腹泻病主要是由致病性大肠埃希菌引起的细菌性腹泻。结合药敏试验，临床可首选氟哌酸、氧氟沙星、菌必治、先锋噻肟等药物进行治疗。

表1 分离菌株生化试验结果Table 1 The results of biochemical test of isolated bacteria

3 讨论

经过粪便革兰染色和微生物学诊断确定，从腹泻犊牛病料中分离到的菌株大多是大肠埃希菌，其中5份粪样中都确定是大肠埃希菌感染，可见引发该牛场犊牛腹泻的病原菌主要是大肠埃希菌。结合流行病学调查和临床诊断，可以确诊该牛场发生的为犊牛大肠埃希菌引起的腹泻病。

犊牛腹泻的因素很多，包括营养不良或者是由大肠埃希菌、沙门菌、绿脓杆菌、轮状病毒、隐性孢子虫等致病微生物单独感染或者混合感染引起。本次试验并没有分离到沙门菌、绿脓杆菌、隐性孢子虫等。由于时间及试验条件的限制，是否还有轮状病毒混合感染还需做进一步的研究。

动物致病性试验结果表明，分离到的大肠埃希菌毒力较强，可使小鼠的发病率达100%，死亡率达67%。

本次分离到的6株致病性大肠埃希菌因条件所限最终没有确定其血清型，尚待进一步研究。在实际生产中，我们可以根据血清型试验确定致病菌的血清型，并进行抗原制备，从而进行免疫预防。大肠埃希菌的血清型复杂多样，优势血清型也存在差异，因此筛选地区性免疫原性优良的菌株制作菌苗，是免疫预防的基础［12］。近些年来，为了控制和预防某些细菌感染，在饲料添加剂及治疗中常盲目使用一些抗菌药物，导致产生许多耐药菌株。大肠埃希菌易产生对抗生素的耐受性。由药敏试验结果可见，致病菌对氯霉素、菌必治、氧氟沙星、阿米卡星及卡那霉素等高度敏感；对妥布霉素、呋喃妥因和复达欣等中度敏感；对链霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、利福平、复方新诺明、万古霉素、四环素及红霉素等耐药，这可能与该场长期或大量使用该类药物，使致病菌已产生耐药性有关。因此，应当通过药敏试验确定敏感药物。同时在药物防治方面，不要盲目的长期大剂量使用某种药物，以免造成耐药菌株的出现。临床治疗时，建议先进行药敏试验选出高敏药物，并注意配合补液、收敛等对症疗法以提高治疗效果。

通过本试验，笔者有一些体会，希望能对临床诊断有所借鉴。在本试验中病原菌的分离是个关键的环节。在病原菌的分离鉴定中，应时刻注意无菌操作，以保证分离到病原菌的纯培养物。采集病料时，应采取含病原菌最多的组织或具有明显病变的组织，以保证能顺利分离到病原。待检材料应该放到灭菌容器中，整个取材过程要求无菌操作。能否获得纯培养，在很大程度上取决于分离技术。在接种时要使用尽可能少的待检材料，使所含细菌细胞在培养基上尽可能的分散开，这样才有利于形成很多的单个菌落，从而顺利获得纯培养。

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