染料木黄酮对大鼠异位子宫内膜组织中MMP-9、TIMP-1表达的影响

郑 兰 朴松哲 金延泽，*

1.吉林省延边大学附属医院妇产科(延吉，133000);2.吉林省延边大学附属医院核医学科

子宫内膜异位症(EMs)具有种植、浸润、扩散、远处转移及复发等类似于恶性肿瘤的特点，一些肿瘤相关因子如基质金属蛋白酶(MMPs)在内膜异位症中的作用日益受到重视，基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是其天然特异性抑制因子。近年研究表明，二者体内表达与EMs的发生、发展密切相关。本实验通过建立大鼠EMs模型，观察染料木黄酮(GEN)治疗后移植物的体积变化和病理学改变，探讨GEN对大鼠EMs组织中MMP-9和TIMP-1表达的影响，为临床治疗EMs提供一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试剂

体重200～250g的Wistar雌性大鼠68只(清洁级)由延边大学基础医学院动物科提供。GEN购于西安中鑫生物技术有限公司;17β-雌二醇购于北京天利生物化工公司;MMP-9兔抗大鼠多克隆抗体(即用型)、TIMP-1兔抗大鼠多克隆抗体(即用型)、SABC(兔IgG)-POD试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EMs模型建立 选择有两个以上正常动情周期(阴道涂片为大量无核角化细胞)的大鼠。造模前一天每只鼠皮下注射己烯雌酚0.1mg/kg.d，使其统一处于动情期。模型组(60只):10%的水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉，腹部备皮，切口约2cm，钝镊找到并分离出大鼠右侧子宫，在右侧子宫靠近输卵管处及两侧子宫交接处分别结扎，剪下中间的子宫片段，迅速置于盛有生理盐水的弯盘中，沿系膜部位剪开管状子宫，切割成4mm×4mm大小的子宫片，注意区分内外膜。钝性分离腹壁切口两侧的腹肌与皮下筋膜层，以正好能置入子宫片为宜，左右各一，分别将切割好的子宫片平整地置入两侧腔隙底部，使内膜面紧贴腹肌，逐层连续缝合腹部切口，常规关腹。注意观察大鼠的呼吸、心跳，等待其自然苏醒。正常组(A组，8只):开腹之前同造模组，腹后将右侧子宫角结扎，常规关腹。目的使该组达到与模型组均为单侧宫角子宫的生殖环境。

1.2.2 术后处理方法 术后所有大鼠均常规禁食水6h，并肌内注射青霉素0.1ml/d预防感染，共5d。术后第2天开始为造模组大鼠肌注17β-雌二醇0.1mg/kg.d，溶解于 0.1ml芝麻油中，每隔 3d 1 次共21d，以促进异位内膜生长。假手术组仅注射同剂量芝麻油。手术后每周观察2次，有无形成包块，21d后观察移植物的生长情况，用游标卡尺测量移植物的体积(长×宽×高，mm3)并记录，术后无大鼠因感染死亡。

1.2.3 实验分组及给药方法 将EMs组大鼠随机分为4组:模型组(B组，15只)每日皮下注射芝麻油0.05ml。GEN治疗组分为低剂量组(C 组，0.5mg/kg，15 只)，中剂量组(D 组，5mg/kg，15 只)，高剂量组(E 组，100mg/kg，15 只)，将 GEN 溶解于 0.05ml芝麻油中，日1次皮下注射，A组同B组每日皮下注射芝麻油 0.05ml，共 84d。

1.2.4 病理检查 末次给药后24h时取出移植物测量其体积。全部标本经10%中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋，切片厚4～5μm，HE染色，光镜下观察。

1.2.5 观察指标 治疗前、后造模组大鼠移植物体积变化;病理学变化;全部标本做HE染色，观察各组移植物腺体厚度和内膜上皮细胞的厚度;观察移植物内膜中MMP-9和TIMP-1的表达。

1.2.6 结果判定 MMP-9阳性判断标准为腺上皮细胞胞浆呈棕黄色着色，间质中也有表达。随机选取高倍镜(×400)下至少5个视野［1］，结果按染色强度分为阴性(-)，弱阳性(+)，中等阳性(++)，强阳性(+++)。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS14.0软件进行统计学处理，采用Fisher确切概率法。

2 结果

2.1 治疗前后移植物体积变化

造模后第3周，所有造模组大鼠左或右下腹可见子宫内膜种植结节。剪去大鼠腹部毛发可见种植物呈类球形突出，其内部充满淡黄色或淡红色液体，与周围组织有轻度粘连。GEN治疗12周后，C组、D组大鼠种植物肉眼观察治疗前后情况相近，测量体积无明显差异;E组移植物萎缩成扁平的斑块状物，治疗前后体积有差异(P＜0.01)。见表1。

2.2 移植物镜下观察

EMs组60只大鼠，镜下观察建模成功41只。A组子宫内膜腺体无扩张，腺上皮排列规整，间质少量炎细胞浸润;B组腺体存活良好，部分腺体扩张，囊壁内泡沫细胞浸润，腺腔内充满蛋白样物;C组与B组比较移植物腺体无明显变化，腺体周围少量纤维组织增生;D组腺体轻度扩张，腺上皮被挤压，变扁，部分处脱落，周围泡沫细胞浸润，腺体周围较多纤维组织增生。E组腺体明显萎缩，部分脱落入腔内，脱落超过50%，腺上皮被挤压，变扁，周围大量纤维组织增生。见图1。

表1 各组GEN治疗前后移植物体积比较(mm3，±s)

表1 各组GEN治疗前后移植物体积比较(mm3，±s)

组 别 n 11 141.26 ±12.01 146.34 ±21.33 C 组(低剂量组) 9 130.95 ±20.18 139.62 ±25.47 D 组(中剂量组) 10 132.60 ±24.61 116.00 ±26.64 E组(高剂量组)治疗前 治疗后B组(模型组)11 133.10 ±28.82 72.74 ±21.44

2.3 免疫组化分析

2.3.1 MMP -9表达情况 B 组(8 例，74.7%)与 A组(1例，12.5%)内膜组织中MMP-9阳性表达率明显增高(P ＜0.05);C 组(6例，66.7%)、D 组(6例，60.0%)与B组比较MMP-9阳性表达率无明显差异;E组(2例，18.2%)与B组比较MMP-9阳性表达率明显下降(P＜0.05)。见图2。

2.3.2 TIMP -1 的表达情况 B 组(3例，27.3%)与A组(7例，87.5%)TIMP-1阳性表达率明显降低(P ＜0.01);C 组(4例，44.4%)、D 组(5例，50.0%)与B组比较TIMP-1阳性表达率无明显差异(P＞0.05);E组(9例，81.8%)与 B组比较TIMP-1阳性表达率升高(P＜0.05)。见图3。

3 讨论

EMs是一种激素依赖性疾病，具有类似恶性肿瘤的特性，即远处转移和侵袭的特性。细胞外基质(ECM)的降解和重建是子宫内膜异位症发病的关键环节［2］。MMPs是一组能降解大多数 ECM及各种类型胶原的锌依赖性蛋白水解酶，在许多生理和病理过程中都发挥着重要作用。其中MMP-9由于经常表达于具有高转移潜能的癌株而备受关注，TIMPs是近年来发现的MMPs的天然抑制物，二者在协调ECM成分的合成与降解过程中起重要作用。本实验中，MMP-9和TIMP-1在正常子宫内膜及EMs组织中均有阳性表达，主要表达于子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞胞浆中。B组中异位内膜组织MMP-9异常高表达，而TIMP-1表达水平降低。MMP-9与TIMP-1表达失衡，可能改变了腹腔ECM的生长和重建过程，促使ECM降解，增强子宫内膜异位症病灶的侵袭性，从而有助于EMs的发生发展［3］。由此可见EMs组织中MMP-9表达增强，TIMP-1表达减弱，与EMs发生、发展密切相关［4］，MMP-9与TIMP-1表达失衡可能是EMs发病的机制之一。

实验结果表明:GEN可以抑制大鼠EMs组织腺体中MMP-9阳性表达，GEN高剂量组效果最为明显，GEN低剂量组和中剂量组无明显差异，MMP-9表达与GEN剂量成量效关系，高剂量的GEN抑制大鼠EMs组织腺体中MMP-9的过度表达，抑制其降解ECM的能力，阻止异位子宫内膜细胞不断破坏基底膜，降解腹膜及周围组织，达到治疗效果。免疫组化结果显示:GEN具有上调大鼠EMs组织腺体中TIMP-1阳性表达的作用，增强了EMC的防御能力，使异位子宫内膜细胞在腹腔内种植、生长、扩散的能力减弱。GEN治疗后EMs组织中MMP-9表达下降，TIMP-1表达升高，说明GEN可以下调MMP-9且上调TIMP-1的表达，恢复二者间的平衡，抑制ECM的降解，增强其防御能力，抑制异位内膜细胞在腹腔内种植、生长、扩散。另外，有试验和临床数据表明，异位内膜组织越多，其周围血供就越丰富，在异位内膜组织中，MMP-9高表达和TIMP-1低表达与异位病灶区血管生成呈正相关［5］，为EMs增殖、扩散创造了条件。GEN能下调MMP-9的表达水平，上调TIMP-1的表达水平，调节MMP-9/TIMP-1之间的平衡，抑制血管生成素诱导的血管内皮细胞出芽生长等，防止ECM降解，维持血管稳定性，抑制EMs的发展。

GEN可抑制大鼠EMs模型中异位内膜的生长，其抑制作用可能与MMP-9表达下降和TIMP-1表达升高，平衡MMP-9和TIMP-1的表达有关。GEN有望成为一种治疗EMs的新物质，MMP-9/TIMP-l的调节受多种因素影响，其确切机制还有待进一步研究。

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3 Paraskeva PA，Ridgway PF，Olsen S，et al.A surgically induced hypoxic environme-nt causes changes in the metastatic behaviour of tumours in vitro［J］.Clin Exp Metastasis，2006，23(2):149 - 157.

4 Salata IM，Stojanovic N，Cajdler- Luba A，et al.Gelatinase A(MMP-2)，gelatinase B(MMP-9)and their inhibitors(TIMP -1，TIMP-2)in serum of women with endometriosis:Significant correlation between MMP-2，MMP-9 and their Inhibitors without difference in levels ofmatrixmetalloproteinases and tissue Inhibitors ofmetalloproteinases in relation to the severity of endometriosis［J］.Gynecol Endocrinol，2008，24(6):326 -330.

5 Ria R，Loverroq G，Vacca A，et al.Angiogenesis extent and expression ofmatrixmetalloproteinase-2 and- 9 agree with progression of ovarian endometriomas［J］.Eur JClin Invest，2002，32(3):199 -206.

［责任编辑:王丽娜］