表皮生长因子及其受体、转化生长因子－α在实验性胃溃疡愈合中的作用

张 静，房 涛，马义腾，吴靖芳，张江兰，张文静

（1．河北北方学院组织胚胎学教研室，河北 张家口075000；2．河北省张家口市第一医院心胸外科，河北 张家口075000；3．河北北方学院临床医学本科2010级2班，河北 张家口075000）

胃溃疡是消化系统较为常见的疾病之一，全球约有10%的人患有此病［1］，其病理变化主要表现为黏膜完整性的破坏。溃疡后的黏膜修复过程直接关系到疾病的转归，这一过程是多种分子相互作用的复杂过程［2－3］。胃黏膜表皮生长因子 （epidermal growth factor，EGF）及其受体 （epidermal growth factor receptor，EGFR）、转化生长因子 （transforming growth factor－alpha，TGF－α）是重要的黏膜保护因子，在维持胃黏膜的完整性和促进胃黏膜的增殖、修复中发挥重要作用。本研究通过建立实验性大鼠胃溃疡模型，对胃黏膜EGF、EGFR、TGF－α进行定位及定量检测，探讨它们在胃黏膜修复过程中的意义。

1 材料和方法

1．1 材料与试剂

雄性8周龄SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，共48只，体质量180～230 g。兔抗大鼠EGF、EGFR、TGF－α多克隆抗体购自武汉博士德生物技术有限公司；SP9001试剂盒、DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1．2 方法

1．2．1 动物模型建立及取材 48只大鼠按照随机数字表法分为实验性胃溃疡组 （简称溃疡组，n＝42）和正常组（n＝6）。正常组为正常大鼠，不做任何处理。模型组用0．3 g·L－1戊巴比妥钠（40 mg·kg－1）腹腔麻醉大鼠，在无菌条件下 （手术切口长约2 cm）暴露胃。在胃体前壁近胃窦处黏膜下注入0．01 m L冰醋酸，制成胃溃疡模型。各实验组分别于溃疡手术后1、2、4、6、10、14和23 d取大鼠胃壁组织 （每个时间点6只），正常组与1 d同时取材。各组动物饲养条件相同，取材前禁食12 h，不限饮水。动物用戊巴比妥钠麻醉后，迅速开胸，主动脉插管，剪开右心耳，首先灌注生理盐水100 m L，继之灌注4%多聚甲醛磷酸缓冲液 （p H 7．4）250 m L，维持20 min全身固定。取材时沿胃大弯剪开大鼠胃壁，冰生理盐水冲洗，溃疡组剪取溃疡边缘组织，正常组剪取近胃窦处胃组织，置于Bouin’s液中，石蜡包埋，连续切片，厚4μm，裱贴于涂有APES的载片，行HE染色和免疫组化染色。

1．2．2 免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡至水，枸橼酸缓冲液 （p H 6．0）95℃，15 min微波热修复，3%甲醇－H2O2去除内源性过氧化物酶，滴加一抗 （三种抗体工作液浓度均为1∶100），4℃孵育过夜，其余步骤按中杉金桥SP9001试剂盒步骤操作。常规DAB显色，苏木精复染细胞核，以PBS代替一抗作为对照。

1．3 图像分析与统计学方法

采用Motic6．0软件进行图像半定量分析，每张切片随机选取5个视野 （×200），测定各实验组大鼠胃黏膜阳性目标积分光密度。所有数据均以 （±s）表示，应用SPSS 17．0统计软件进行单因素方差分析和q检验。

2 结 果

2．1 造模后胃黏膜组织形态学变化

胃溃疡术后1 d，大鼠胃体前壁即可见一个直径约4 mm的溃疡，苍白色，圆形或椭圆形，边界清楚，周围黏膜呈环堤样水肿隆起；术后2～4 d溃疡最为明显，溃疡底部凹陷加深 （封二图1），并可见穿孔或者被大网膜、胰腺、肝脏等组织黏连包裹；随后溃疡面积逐渐减小，至14 d左右溃疡直径缩小至1～2 mm，逐渐形成瘢痕组织；溃疡术后23 d部分已经接近愈合。HE染色切片在光镜下观察可见溃疡部位黏膜缺损，腺体减少消失，炎性细胞浸润 （封二图2），溃疡术后6 d腺体数量增多可呈扩张状，至修复后期黏膜结构逐渐完整。

2．2 胃黏膜EGF、EGFR、TGF－α表达变化

阳性反应物质均呈棕黄色。正常组大鼠胃黏膜三种蛋白均呈弱阳性表达 （封二图3），溃疡术后1 d，EGF阳性细胞与正常组相比略有增多 （P＜0．05），EGFR阳性细胞增多较为明显 （P＜0．05），TGF－α表达从溃疡术后2 d增强较为明显 （P＜0．01）。之后 （4～10 d）三者表达均呈增强趋势，阳性细胞数量明显增多，表达明显增强。至溃疡术后10 d，EGF、TGF－α阳性细胞积分光密度值达到高峰 （封二图4，6），EGFR阳性细胞于术后6 d表达最强 （封二图5）。溃疡修复后期 （14，23 d）三者阳性细胞积分光密度值虽略有降低，但仍显著高于正常组 （P＜0．01）。EGF、EGFR、TGF－α主要表达于胃底腺细胞，可见壁细胞阳性表达、也可见胞体呈锥体形、具有突起的内分泌细胞表达。三种蛋白均可见胞质表达，EGFR还可见胞膜表达，阳性信号以靠近黏膜肌层为强。各实验组EGF、EGFR、TGF－α积分光密度值见表1。

表1 大鼠胃黏膜EGF、EGFR、TGF－α阳性细胞积分光密度值变化 ±s）

表1 大鼠胃黏膜EGF、EGFR、TGF－α阳性细胞积分光密度值变化 ±s）

注：与正常组比较▲P＜0．05，▲▲P＜0．01；与前一溃疡组相比＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

23 d EGF 2．53±0．63 4．10±1．05▲ 6．80±1．31▲▲＊＊ 12．30±0．62▲▲＊＊ 16．52±0．68▲▲＊＊ 19．10±0．46▲▲＊＊ 17．24±2．05▲▲＊＊ 16．68±1．88组别 正常组 溃疡1 d 溃疡2 d 溃疡4 d 溃疡6 d 溃疡10 d 溃疡14 d 溃疡▲▲EGFR 3．30±0．31 7．60±0．49▲▲11．76±0．62▲▲＊＊ 15．02±0．66▲▲＊＊ 17．84±1．05▲▲＊＊ 17．50±0．61▲▲ 16．86±0．92▲▲ 15．82±0．87▲▲＊TGF－α 2．37±0．55 2．76±0．65 7．12±0．59▲▲＊＊ 10．73±1．19▲▲＊＊ 15．20±1．18▲▲＊＊ 18．73±1．36▲▲＊＊ 17．27±0．56▲▲＊ 17．05±1．22▲▲

3 讨 论

研究发现，一旦溃疡形成，无论原因如何，其修复及愈合均经历相似的过程［4］。目前在溃疡愈合方面提出了QOUH （quality of ulcer healing，溃疡愈合质量）的概念，包括缺失黏膜的修复以及黏膜下组织结构与功能的重建［5］。EGF、TGF－α是一组能直接影响QOUH的表皮生长因子相关蛋白家族成员，它们通过作用于共同的受体EGFR，发挥他们黏膜修复与重建的功能。因此我们采用能较好模拟人类胃溃疡的大鼠乙酸胃溃疡模型，对胃黏膜EGF、EGFR、TGF－α进行定位及定量检测，研究它们在胃黏膜修复过程中的变化及意义，有助于明确胃溃疡黏膜愈合和修复机制，为胃溃疡临床治疗及药物筛选提供实验依据。

EGF在唾液腺和十二指肠Brunner腺中分泌较为丰富，是由53个氨基酸组成的单链蛋白质，是一种重要的促进溃疡愈合的调节因子［6］。TGF－α是另一参与胃黏膜修复的主要调节肽，成熟肽由50个氨基酸组成，产生于整个胃肠道，是维持黏膜完整性的重要介质，被称为 “黏膜完整肽”。TGF－α与EGF有35%的序列同源性，因此二者具有相似的生物活性，并且结合同一个受体［7－8］。EGF与TGF－α都具有促进胃黏膜上皮细胞增殖、成纤维细胞的生长以及胶原产生的作用，同时它们还可抑制胃酸分泌，增加胃黏膜血流量，参与黏膜上皮的更新以及损伤后的修复［8］。此外二者具有耐热和不被蛋白酶消化的特性［8］，有利于它们长时间作用于胃肠道黏膜，因此这两种生长因子在溃疡修复中扮演着重要的角色。EGFR是一种单链跨膜糖蛋白，并具有酪氨酸激酶活性，有EGF及TGF－α两种配体，它们通过自分泌或旁分泌与EGFR结合并使之激活，诱导其磷酸化，提供持续分裂信号到细胞内，引起细胞增殖分化［9］。

从我们的实验结果分析，正常大鼠胃黏膜EGF、EGFR、TGF－α弱阳性表达是维持胃黏膜完整性的结构基础。在大鼠胃溃疡形成和愈合早期，三者表达明显增多，之后呈现上升趋势，在愈合后期表达水平略有下降，但显著高于正常组 （P＜0．01），三种指标的表达趋势与胃溃疡愈合是一致的，说明在胃溃疡愈合过程中，胃黏膜自身可产生EGF、EGFR、TGF－α参与黏膜修复过程。但从表达时相上三者略有不同，EGFR在术后1 d增多就较为明显 （P＜0．01），术后6 d表达最强；EGF在溃疡术后1 d与正常组相比略有增多 （P＜0．05），于10 d积分光密度值达到峰值；TGF－α是于溃疡术后2 d增多较为明显（P＜0．01），在溃疡10 d时阳性细胞最多，表达最强。国外研究中发现，EGFR作为初始反应蛋白最早出现在黏膜损伤后，而EGF作为中间反应蛋白出现时间滞后于EGFR［10］，这与我们的实验结果是一致的。TGF－α虽然在国内外文献中并未提及它的表达时相，但由于TGF－α与EGF在结构上具有同源性，因此它与EGF的时相变化基本是一致的，这也体现在我们的实验结果中。

从我们的定位检测结果看，三种指标在表达部位上具有相同的特点。三种阳性细胞主要分布于近黏膜肌层，此部位与胃腺增殖关系密切，此部位细胞增殖核抗原 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达阳性［11］，推断此表达特点可能与它们具有促进胃黏膜细胞分裂、分化等作用有关，这是黏膜损伤后修复的必要条件。同时三种阳性物质除见于内分泌细胞中，也可见表达于壁细胞中，此定位特点应与其抑制盐酸分泌的特性有关。阳性细胞胞膜以及胞质表达的EGFR能和EGF、TGF－α发生特异性结合，是它们发挥抑酸、促细胞增殖等作用的蛋白基础。

在大鼠胃溃疡自愈时期胃黏膜能特异性表达内源性EGF、EGFR、TGF－α，它们共同参与了溃疡愈合过程，通过自分泌或旁分泌的方式相互影响，相互作用，共同促进胃黏膜的修复。目前研发的抗溃疡药正是通过生长因子的介导而提高QOUL，减少溃疡复发。因此，对生长因子的研究有助于寻找抗消化性溃疡药物开发的新靶点。目前，国内已研制成功重组h EGF并用于溃疡病的治疗，而研究发现TGF－α与EGFR的结合能力更强［8］，这给TGF－α应用于临床提供了更好的前景。同时促进EGFR的表达更是发挥治疗作用的关键环节。

［1］ 成虹，胡伏莲，袁申元，等．北京地区消化性溃疡流行病学分析 ［J］．世界华人消化杂志，2007，15（33）：3518－3523．

［2］ Nie SN，Qian XM，Wu XH，et al．Role of TFF in healing of stress－induced gastric lesions ［J］．World J Gastroenterol，2003，9 （8）：1772－1776．

［3］ 张慧芹，房涛，程彦龙，等．大鼠实验性胃溃疡自愈期间胃黏膜5－HT和NPY的变化 ［J］．河北北方学院学报：医学版，2010，27 （4）：19－22．

［4］ 樊留博，马利中，李瀛，等．针刺对乙酸诱发大鼠胃溃疡愈合质量的影响 ［J］．中国中医急症，2006，15（11）：1259－1260．

［5］ Qi Z，Jie L，Haixia C，et al．Effect of rebamipide on quality of peptic ulcer healing in rat ［J］．Dig Dis Sci，2009，54（9）：1876－1883．

［6］ Elliott SN，Wallace JL，Mc Knight W，et al．Bacterial colonization and healing of gastric ulcers：the effects of epidermal growth factor ［J］．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，278 （1）：105－112．

［7］ Turner JR，Liu L，Fligiel SE，et al．Aging alters gastric mucosal responses to epidermal growth factor and transforming growth factor－alpha ［J］．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，278 （5）：G805－G810．

［8］ Alison MR，Chinery R，Poulsom R，et al．Experimental ulceration leads to sequential expression of spasmolytic polypeptide，intestinal trefoil factor，epidermal growth factor and transforming growth factor－alpha m RNAs in rat stomach［J］．J Pathol，1995，175 （4）：405－414．

［9］ 林久茂，周建衡，钟晓勇，等．前列宁胶囊对BPH大鼠EGF、EGFR表达的影响 ［J］．福建中医药，2010，41（6）：45－47．

［10］ Syam AF，Sadikin M，Wanandi SI，et al．Molecular mechanism on healing process of peptic ulcer ［J］．Acta Med Indones，2009，41 （2）：95－98．

［11］ Yamaguchi H，Goldenring JR，Kaminishi M，et al．Association of spasmolytic polypeptide－expressing metaplasia with carcinogen administration and oxyntic atrophy in rats ［J］．Lab Invest，2002，82 （8）：1045－1052．