凤尾草抗衰老作用研究

汪 燕， 邵建兵， 严小萍

(江苏省如皋市人民医院药剂科， 江苏 如皋 226500)

凤尾草为凤尾蕨科植物凤尾草(Pteris multifida Poir)的全草或根，具有清热解毒、凉血止血、消肿解毒等功效，民间用于治疗肝炎、菌痢、淋浊、便血、扁桃体炎、痈肿疮毒、湿疹等［1］。现代药理研究表明，凤尾草含黄酮类、萜类化合物、甾醇类、挥发油、苯丙素类等成分，具有广谱抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧自由基作用［2，3］。本文以衰老的自由基学说和免疫学说作为理论依据，分析探讨凤尾草抗衰老的作用及其机制，为凤尾草的开发和利用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 仪器:电子天平(BP221S，德国赛博尼斯);匀浆器(IKA T10，IKA公司);涡旋仪(XW－80A，上海沪西分析仪器厂);台式离心机(SiGMA 1－13，美国SiGMA公司);迅达半自动生化仪(C－82，上海迅达医疗仪器有限公司)。

1.2 试剂与动物:凤尾草(江苏九泰医药集团);D－半乳糖(D－Galactose)(国药集团化学试剂有限公司);一氧化氮(NO)试剂盒(硝酸还原法)、一氧化氮合酶(NOS)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。清洁级昆明种小鼠70只，雄性，体重20±1g，江苏大学动物实验中心(合格证号:苏动质95040)。

2 实验方法

2.1 凤尾草醇提物灌胃液制备:准确称取20g凤尾草粉末(过40目筛)，置烧瓶中，加入450m L70%乙醇，室温下浸泡12h后，超声提取30min，抽滤，残渣再超声提取一次，合并两次滤液，浓缩烘干，得到凤尾草醇提物，临用前取提取物加水配制成9mg/mL混悬液灌胃。

2.2 造模与分组:小鼠随机分为空白对照组(B)、衰老模型组(m)、凤尾草醇提物低剂量组(g1)，中剂量组(g2)，高剂量组(g3)。分组后即进行衰老模型制备:模型组和各给药组颈部皮下注射D－半乳糖200mg·kg－1·d－1，空白对照组颈部皮下注射等量生理盐水，30d后，从空白对照组与模型组各取10只小鼠，颈脱椎处死，测定各项指标［4］，确定造模成功后，给药组按81mg·kg－1·d－1，108mg·kg－1·d－1，135mg·kg－1·d－1分别灌胃给药，模型对照组和空白组灌胃生理盐水10mL·kg－1·d－1，15d 后处死所有小鼠，分取脑、胸腺和脾脏，测定各项指标，按下式计算脏器系数:脏器系数=(脏器重量/小鼠重量)×100%。

2.3 小鼠脑组织中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)含量测定:饲养45d后动物脱颈椎处死，取脑，生理盐水冲洗，拭干。精确称取脑组织，加9倍体积氯化钠溶液，匀浆，制取10%的脑组织匀浆待测。按照NO硝酸还原酶法试剂盒说明配制各试剂，540nm处测吸光度。同样处理标本，按照NOS测试盒(测总NOS)说明配制各试剂，530nm测吸光度。

2.4 统计学处理:采用Graph Pad软件(Prism 5，version 5.01)进行方差分析。

表1 小鼠脾脏和胸腺系数的变化

3 实验结果

3.1 凤尾草醇提物对小鼠免疫器官的影响:结果如表1所示，与空白组相比，模型组小鼠胸腺和脾脏系数变化均具统计学意义，表明该衰老小鼠模型体现免疫器官的变化。与空白对照组(b)相比，衰老模型组(m)胸腺指数和脾脏指数明显降低，免疫器官代偿性增重;与衰老模型组比较，模型给药组能显著提高脾脏指数，且呈现剂量关系。

从各组小鼠的胸腺、脾免疫器官的变化可以看出，D－半乳糖致衰老模型小鼠胸腺、脾免疫器官较空白组小鼠胸腺、脾免疫器官明显萎缩，而凤尾草具有增加衰老小鼠胸腺和脾的重量，提升免疫功能的作用。

3.2 凤尾草醇提物对小鼠脑组织中NO含量的影响:结果见图1，与正常对照组相比，衰老模型组小鼠脑组织中NO含量明显提高;给药组小鼠脑组织中NO含量显著低于衰老模型组;各给药组NO含量与空白组NO含量无显著差异(P＞0.05);给药组NO含量呈剂量关系。表明凤尾草可以显著对抗小鼠脑组织氧自由基NO，从而起到延缓小鼠衰老的作用。

图1:给药小鼠脑组织中NO含量bvsm，p＜0.05;mvsg1、mvsg2 及mvsg3，P均小于0.05

3.3 凤尾草醇提物对小鼠脑组织中NOS活力的影响:结果如图2所示，与正常对照组(b)相比，衰老模型组(m)小鼠脑组织中NOS活性显著升高;各给药组小鼠脑组织中NOS活性显著低于衰老模型组;各模型给药组小鼠脑组织中NOS活性与空白组(b)无显著差异，说明凤尾草可能通过降低NOS活力对延缓小鼠衰老起作用，

图2:给药小鼠脑组织中NOS活力bvsm，P＜0.05;mvsg1、mvsg2及mvsg3，P均小于0.05

4 讨论

4.1 D－半乳糖衰老模型是目前较多用的一种人工催老模型，具有衰老变化明显、模型稳定、耗时短等特点。D－半乳糖造成衰老模型是因代谢过程中机体产生大量自由基，其表现为多种抗氧化酶活性下降，引起小鼠的脑老化效应［5］，并在多种器官、组织的形态及生理、生化的许多观测指标上，均呈现出与自然衰老相似的改变［6］。

4.2 NO参与调节神经系统、心血管系统及呼吸消化系统的功能和介导免疫应答等诸多生理和病理过程，是体内重要的信使分子和神经递质，与脑部学习及记忆密切相关;同时又是一种极不稳定的强氧化剂，过量的NO则会作为强氧化剂与超氧阴离子发生反应，产生细胞毒性更强的过氧化硝基基团，对细胞产生毒性从而导致衰老的发生［7］。NOS是NO产生的关键酶，研究表明，较低剂量的硝普钠(Sodium Nitroprusside)能在体内自发性释放出NO，能使大鼠学习成绩提高。而NOS阻断剂则使其学习成绩下降;较高剂量的硝普钠也可使学习成绩降低，说明适量的NO可促进学习能力，而过量的NO释放则具有神经毒性［8］。Cutler等研究了12种灵长类和两种啮齿类动物肝、脑和血浆等组织中的抗氧化性物质，比较了这些动物的最大寿命与抗氧化能力间的关系，结果表明，机体自由基生成量越少，抗氧化力(清除能力)越强，最大寿命就越大。氧自由基是衰老的决定因素，在衰老进程中起着至关重要的作用。因此，如能减少自由基生成和增强机体抗自由基能力、有效维持二者之间的动态平衡，必定会有延缓衰老、促进健康的作用［9］。

4.3 NO化学性质活泼，半衰期很短，在体内很快就代谢转为 NO2－和 NO3－，而 NO2－又进一步转化为 NO3－，采用硝酸还原酶法可特异性地将 NO3－还原为NO2－，NO2－与Griess试剂发生重氮反应生成粉红色化合物，通过显色深浅利用分光光度计在540nm处检测其吸光度，吸光度与其浓度的高低呈正比。NOS催化LArg和分子氧反应生成NO，NO与亲核性物质生成有色化合物，在530nm波长处测定吸光度，根据吸光度的大小可计算出NOS活力。

4.4 衰老的免疫学说认为，胸腺是免疫系统的中枢器官，其衰退则T细胞减少，免疫杀伤力明显降低，T细胞调控B细胞分泌抗体功能下降，产生自身免疫、T细胞分泌白细胞介素的能力下降，吞噬细胞能力和分泌干扰素的能力下降，整体免疫功能下降，导致免疫防御能力低下，易受感染、病变和衰老。脾脏中有T淋巴细胞和B淋巴细胞，还有巨噬细胞，与体液免疫、细胞免疫均有密切关系，一些免疫增强剂可使胸腺和脾脏增重［6］。本实验结果显示，模型给药组胸腺和脾的重量与对照组接近，无显著性差异(P＞0.05)，表明凤尾草醇提物对胸腺和脾的功能状态的良性影响，可改善机体的免疫功能。

4.5 本实验研究表明，不同剂量的凤尾草醇提物均可以对抗小鼠脑组织氧自由基NO，从而起到延缓小鼠衰老的作用，并呈现一定的剂量效应，综上所述，凤尾草醇提物抗衰老作用的机制可能有:①通过对抗小鼠脑组织氧自由基NO、抑制NOS活性、清除自由基NO，阻断自由基链锁反应，降低NO含量，发挥抗衰老作用。②凤尾草醇提物通过对胸腺和脾脏等免疫器官功能状态的改善，提高机体的免疫能力，增强机体的抗衰老作用。

［1］ 江苏新医学院.中药大辞典上册［M］.上海:上海科学技术出版社，1993.487.

［2］ 余有贵，赵良忠，段林东，等.凤尾草抗菌药物的提取与开发研究［J］.邵阳高等专科学校学报，2001，(3):199－203.

［3］ T.C.Wang，M.C.Ti，S.C.Lo，et al.Free radical－scavenging activity of aqueous extract of pteris multifida poiret［J］.Fitoterapia，2007，(78):248－249.

［4］ 龚国清，徐本.小鼠衰老模型研究［J］.中国药科大学学报，1991，22(2):101－103.

［5］ 李文彬，韦丰，范明，等.D－半乳糖在小鼠诱导的拟老化效应［J］.中国药学与毒理学杂志，1995，9(2):94－95.

［6］ 李笑萍，俞培先，赵东.D－半乳糖衰老模型的新指标［J］.中国现代应用药学杂志，2004，21(6):443.

［7］ 马厚勋，曾凡荣，曾昭淳.NO生物学作用及其与衰老的关系［J］.国外医学老年医学分册，1999，20(4):169.

［8］ 刘勇林，李晨旭，邱学才.脑内NO对大鼠学习功能的影响［J］.北京医科大学学报，1996，28:306.

［9］ 李素云，王立芹，郑稼琳，等.自由基与衰老的研究进展［J］.中国老年学杂志，2007，27(10):2046－2048.