浅谈分子标记技术鉴定玉米种子纯度

杜 爽，张 岩，王 轩

（天津市种子管理站，天津 300061）

玉米种子纯度（是指品种在特征特性方面典型一致的程度）是检查玉米种子质量的重要指标之一，鉴别种子的纯度对玉米生产具有决定性作用。目前，检验方法主要包括田间检验、室内检验和田间种植检验。

随着我国玉米种子市场的快速发展，传统检验手段已存在很大局限性，所以，急需我们建立一套简便、快速、经济和准确的种子纯度检测技术体系。

DNA分子标记技术是以DNA碱基序列的差异进行分析对比，从而鉴别不同品种。其检测对象是种子DNA的片段（基因），并没有器官的特异性，且不受外部环境的影响，所以，有较高的准确性、稳定性和重复性。目前，在玉米品种鉴定中应用的有RFLP技术、RAPD技术、AFLP技术和SSR技术等。

1 RFLP技术

限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，简称 RFLP）指一个品种的DNA片段长度多态性。它是在1974年由Grodzicker等创立一种以DNA-DNA杂交为基础最早发展起来的第一代遗传标记。其原理是用限制性内切酶酶切不同品种的DNA，由于DNA经限制性内切酶消化产生了长度不等、分子质量大小不同的片段，通过琼脂凝胶电泳分离大小不同的DNA片段，转移凝胶中的DNA到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素或生物素标记的探针进行Southern杂交，经放射显影后，可观察待鉴定品种的RFLP指纹，经与标准品种RFLP指纹图谱比较后，即可对此品种进行纯度分析。它反映了DNA序列中核苷酸排列顺序的差异，RFLP标记的多态性来源于基因组限制性酶切位点的突变及相邻位点间DNA结构重排 （包括缺失、重复、异位和插入）。

玉米种子中存在丰富的限制性片段长度的多态性，可作玉米品种的DNA指纹鉴定。RFLP多态性稳定，容易重复，结果准确。但该技术多态有限、成本昂贵且耗时较长，同时放射性同位素的使用会影响人体安全，限制了在实践中的应用。

2 RAPD技术

随机扩增多态性 DNA（Random Amplified Polymorphism DNA，简称 RAPD）是 1990年由美国杜邦公司的Williams和加利福尼亚生物研究所的Welsh等人一起发明的分子标记技术。以DNA为模板，以一个随机的寡核苷酸序列为引物，通过PCR扩增反应，产生不连续的DNA产物，扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用EB或银染色，以检测DNA序列的多态性。胶上呈现出的每条谱带对应品种基因组中的一个遗传位点，不同位点扩增产物的有无构成了品种的多态性。RAPD多态性主要与随机引物结合的靶位点的突变、引物结合位点间DNA碱基序列的缺失和插入有关。RAPD技术与多种指纹图谱分析软件相结合，广泛应用于玉米种质研究及品种纯度鉴定和真实性检测中，在生产上主要应用于新品种（系）、优良单株及有重要应用价值的玉米远缘种鉴定等。

RAPD技术反应灵敏、多态性强、操作简便、速度快且费用低，既有大量的随机引物可供筛选之用，又不受种属的限制。尽管RAPD具有稳定性和重演性差的缺点，但是，有研究指出具有高质量的DNA、稳定的PCR反应条件、稳定的程序、适宜的引物以及在整个过程中设置重复，就能获得理想的纯度鉴定结果。

3 AFLP技术

扩增片段长度多态性（Amplification Fragment Length Polymorphism，简称AFLP）是 1992年由荷兰科学家Zabean等人于1993年发明的一项专利技术，它结合了RFLP与PCR的优点，具RFLP的稳定性和PCR技术的高效。 指植物基因组DNA经限制性内切酶的酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，然后将特定的接头连接在这些DNA片段的两端，形成一个带接头的特定片段.再通过接头序列和PCR引物末端的识别进行PCR扩增，最终通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些特异的限制性片段分离开来，从而显示出扩增片段长度的多态性。得到的DNA图谱可用于品种纯度鉴定。

该技术避免了分子杂交的复杂程序，灵敏度高、快速、多态性强、DNA的用量少且具较好的重复性，在玉米种质资源鉴定和类群划分上得到广泛研究。但是，操作技术较为繁琐、时间长且步骤多，并对操作者实验技能及仪器设备的精密度要求很高，且成本较高（专利技术受专利法保护），当前使其在种子纯度的快速检测普及应用仍存在一段距离，所以该法不适合大面积普及推广。但是，如果该方法能简化并降低成本，将成为极有推广前途的一项种子纯度检测的实用技术。

4 SSR技术

在高等生物基因组合普遍分布着由1～6个碱基组成的简单重复序列 （Simple Sequence Repeat，SSR)， 又称为微卫星 DNA（Microsatellite DNA）。微卫星位点两侧的序列是相当保守的单拷贝序列，可以根据两侧序列设计一对引物进行PCR扩增。然后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或高浓度琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，经EB或银染色，从而精确地检测出特定位点微卫星DNA的长度多态性，这种多态性远多于RFLP的多态性，是一种较为理想的DNA标记技术，在玉米品种鉴定上进行了广泛的研究。由于该标记技术具有共显性、多态性丰富、重复性强、操作简便和快速的特点，非常适于在种子公司及管理部门推广应用，因此，当前被认为是用于玉米品种纯度鉴定的最可靠且实用的分子标记技术。

与其它方法相比，应用分子标记技术鉴定玉米种子纯度具有多态性丰富、准确性高、重复性好及无器官发育时期的特异性等优点，且不受环境影响，但所需仪器精密、药品昂贵，程序复杂。每一种技术都有其自身的优缺点，有些技术还不能大规模应用，还需继续深入完善和研究。因此，在进行具体的种子纯度检测时，应该根据具体情况灵活掌握，充分发挥各种技术优势，综合应用，建立有效的技术体系才能达到准确、经济和快速检测的目的。

[1]宇文强，叶雨盛，戴保威，等.DNA分子标记与玉米种子纯度检验[J].种子，2005，24（12）：38-42.

[2]张秀娟.杂交玉米种子纯度检验[J].中国种业，2009，8：50-51.

[3]张凤.生化指纹图谱技术在品种鉴定中的应用及研究进展[J].种子世界，2009，10： 33-34.

[4]李智军，卢文佳，李春艳，等.鉴定甜玉米品种真伪及种子纯度的 RAPD 引物筛选[J].种子，2010（4）：19-22.

[5]辛景树，郭景伦，张软斌.几种常用分子标记技术在种子纯度和品种真实性鉴定方面的比较与分析[J].种子，2005，24（1）：58-60.

[6]林清，杨华，雷开荣，等.渝糯系列玉米杂种遗传纯度的 RAPD 鉴定[J].西南农业学报，2006，19（2）：182-184.

[7]杜金友，靳占忠，徐兴友，等.AFLP标记在玉米种质资源鉴定中的应用[J].西北植物学报，2006，26（5）：927-932.

[8]李晓辉，李新海，李文华，等.SSR标记技术在玉米杂交种纯度鉴定中的应用[J].作物学报，2003，29（1）：63-68.

[9]郭景伦，赵久然，王凤格.适用于SSR分子标记的玉米单粒种子DNA快速提取新方法[J].玉米科学，2005，13（2）：l6-l7.