MRSA对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺体外诱导耐药性比较

王玉颖，王镇山，薛欣，聂大平

(1.大连医科大学附属第二医院呼吸内科，辽宁大连 116027;2.大连医科大学附属第二医院检验科，辽宁大连 116027)

MRSA对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺体外诱导耐药性比较

王玉颖1，王镇山1，薛欣1，聂大平2

(1.大连医科大学附属第二医院呼吸内科，辽宁大连 116027;2.大连医科大学附属第二医院检验科，辽宁大连 116027)

［目的］通过比较万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺体外诱导耐甲氧西林金葡菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)前后的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)变化，探讨此3种抗菌药物在诱导耐药性上有无差别。［方法］琼脂二倍稀释法检测9株MRSA分别对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺的MIC，筛选出2株对3种药物均敏感的MRSA，用上述3种药物分别诱导2株MRSA25代，最后检测诱导后的MRSA菌株对3种药物的MIC，应用统计学软件进行数据分析。［结果］经万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺分别诱导25代后的MRSA菌株与各自诱导前比较，万古霉素和利奈唑胺的MIC升高2倍，替考拉宁的MIC升高2.67倍，但各组间MIC变化无差别，均未见耐药株产生;各组对照组的MRSA菌株经无药平皿传代，各药对其MIC无变化。［结论］3种抗菌药物在诱导MRSA耐药上无差别。

MRSA;万古霉素;替考拉宁;利奈唑胺;诱导耐药

自20世纪60年代报道耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)出现开始，MRSA的感染率呈逐年上升趋势，目前，MRSA感染已与HBV、AIDS列为世界范围内三大难治感染性疾病，MRSA再次受到各国疾病控制中心的重视。MRSA呈现出的异质性及多重耐药的特点为治疗提出新的挑战［1］。临床常用的抗MRSA药物有万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺。但近年国内外有关万古霉素中介金黄色葡萄球菌(vancomycin－intermediate Staphylococcus aureus，VISA)、异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌(heterogennous vancomycin－intermediate Staphylococcus aureus，h－VISA)、万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(vancomycin－resistant Staphylococcus aureus，VRSA)临床分离株时有报道;国外已有关于耐利奈唑胺MRSA临床分离株的报道;许多学者研究认为与抗菌药物的选择压力有关。已有学者对MRSA进行万古霉素体外诱导耐药研究，发现VRSA不易诱导产生，但MRSA对万古霉素的最低抑菌浓度有所提高，部分菌株转变为 h－VISA［2－3］。本文通过比较万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺体外诱导MRSA前后的MIC变化，探讨此3种药物在诱导耐药性上有无差别。

1 材料和方法

1.1 菌 株

收集2010年8月—2010年10月大连医科大学附属第二医院临床患者的血、痰、分泌物标本，经API－Staph系统鉴定为金黄色葡萄球菌9株。标准参考菌株为ATCC25923，由中国药品生物制品检定所提供。

1.2 培养基及仪器

MH(A)培养基及胰蛋白胨大豆肉汤均为北京奥博星生物技术有限责任公司产品，批号分别为20061125和20070202;培养皿为青岛金典生化器材有限公司产品;多点接种仪进口日本;恒温培养箱为上海跃进医疗器械一厂产品。

1.3 药 物

万古霉素(vancomycin，VAN)为美国 Eli Lilly公司产品，批号为X－100651;替考拉宁(teicoplanin，TEI)为Sanofi Aventis公司的工作对照品，效价为92%;利奈唑胺(linezolid，LIN)为辉瑞公司产品，0.6 g∶300 mL，批号为 10c12z26;苯唑西林(oxacillin，OXA)为中国药品生物制品检定所产品。

1.4 方 法

1.4.1 MIC测定：采用琼脂二倍稀释法和多点接种器定量种菌进行药敏实验。冻存的9株金黄色葡萄球菌菌株接种于MH平皿，于37℃恒温培养24 h后见菌落生长;分别将苯唑西林、万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺配制贮液，用MH肉汤2倍稀释成各种所需浓度，分别加1 mL到平皿中，MH琼脂培养基溶化后分别取19 mL注入含药平皿中混匀，药物终浓度分别为 0.008 μg/mL、0.016 μg/mL、0.032 μg/mL、0.064 μg/mL、0.125 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL、256 μg/mL;将实验菌用MH肉汤配制成107cfu/mL接种于含药平皿，于37℃恒温培养24 h，无菌落生长的平皿中所含药物浓度确定为MIC。各菌株对苯唑西林的MIC均＞4μg/mL，据美国临床实验室标准化委员会的(NCCLS)［6］琼脂二倍稀释法标准验证9菌株均为MRSA;同时筛选出对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺均敏感的2号和4号菌株作为诱导耐药株。

1.4.2 诱导耐药［2－5］：根据万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺分别对各菌株的MIC，将上述3种药物分别配制成1/2倍MIC浓度的含药MH平皿备用;将实验菌接种于MH培养基后37℃恒温培养24 h后见菌落生长，随机取若干菌落分别接种于配制好的含药平皿中37℃恒温培养24 h后见菌落生长，依此反复培养25 d，同时菌株在无药平皿中培养25 d，期间留取第 5代、10代、15代、20代、25代菌株于－20℃冻存备用。

1.4.3 诱导后菌株的MIC测定：采用琼脂二倍稀释法对第5代、10代、15代、20代、25代诱导后菌株测定分别对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺的MIC。若药物诱导后MIC＞4倍诱导前MIC则视为诱导产生耐药，或者MIC升高达NCLS规定耐药标准：万古霉素和替考拉宁的MIC为4～16μg/mL则为中介耐药，＞16μg/mL为耐药;利奈唑胺无耐药株标准。

1.5 统计学方法

应用SPSS 19.0软件进行数据分析。组间计量资料比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MRSA分别对苯唑西林、万古霉素、替考拉宁及利奈唑胺的MIC

各菌株对苯唑西林的MIC均＞4μg/mL，2号和4号对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺均敏感，选择这2种菌株作为诱导耐药株。见表1。

表1 4种抗菌药物对9株MRSA的MICTab 1 The MIC of 4 antibacterials to 9 MRSAs(μg/mL)

2.2 万古霉素、替考拉宁及利奈唑胺对经万古霉素诱导后MRSA的MIC

万古霉素及替考拉宁对经万古霉素诱导后MRSA菌株的MIC升高，但升高＜4倍;利奈唑胺对经万古霉素诱导后MRSA菌株的MIC无变化。见表2。

表2 3种抗菌药物对经万古霉素诱导后MRSA的MICTab 2 The MIC of 3 antibacterials to MRSA after inducing of vancomycin (μg/mL)

2.3 万古霉素、替考拉宁及利奈唑胺对经替考拉宁诱导后MRSA的MIC

万古霉素及替考拉宁对经替考拉宁诱导后MRSA菌株的MIC升高，但升高＜4倍;利奈唑胺对经万古霉素诱导后MRSA菌株的MIC无变化。见表3。

表3 3种抗菌药物对经替考拉宁诱导后MRSA的MICTab 3 The MIC of 3 antibacterials to MRSA after inducing of teicoplanin (μg/mL)

2.4 万古霉素、替考拉宁及利奈唑胺对经利奈唑胺诱导后MRSA的MIC

万古霉素及替考拉宁对经利奈唑胺诱导后MRSA菌株的MIC无变化，利奈唑胺对经利奈唑胺诱导后MRSA菌株的MIC升高，但升高＜4倍。见表4。

表4 3种抗菌药物对经利奈唑胺诱导后MRSA的MICTab 4 The MIC of3 antibacterials to MRSA after inducing of linezolid (μg/mL)

2.5 万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺分别诱导后的MRSA与诱导前比较

万古霉素和利奈唑胺的MIC升高2倍，替考拉宁的MIC升高2.67倍;但各组间MIC变化比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。各对照组的MRSA菌株经无药平皿传代，各药对其MIC无变化。见表5。

3 讨论

自1961年Jevons在英国首次发现MRSA，到70年代末MRSA急剧增多几乎遍及全球，80年代后期已成为全球性的病原微生物，居医院感染病原菌的首位，占大型教学医院分离金黄色葡萄球菌的60%～80%。MRSA呈现出的异质性及多重耐药的特点为治疗提出了挑战［1］。目前常用的抗MRSA药物主要是糖肽类及恶唑烷酮类抗菌药物，临床上常用的糖肽类有万古霉素和替考拉宁，恶唑烷酮类为利奈唑胺。本文旨在通过上述研究帮助指导临床上对这3种药物的选择。

表5 3种药物分别诱导MRSA后的MIC与对照组比较Tab 5 The comparison of MIC of MRSA between after inducing of 3 antibacterials separately and control groups(μg/mL)

本研究显示分别经过替考拉宁、万古霉素诱导后的MRSA对两种药物的MIC与诱导前比较均升高，该结果归因于同类抗菌药物的作用机制相同;故在临床选择更换抗MRSA药物时，应避免选择同类抗菌药物。而恶唑烷酮类药物对经过糖肽类药物诱导后的MRSA与诱导前比较MIC无变化，相反亦然，说明糖肽类抗菌药物与恶唑烷酮类抗菌药物间未见交叉耐药，这与王敬华等［9］的研究结果一致。其主要原因是两类药物的抗菌机制完全不同，糖肽类抗菌药物作用于细菌细胞壁，而恶唑烷酮类抗菌药物作用于细菌的蛋白质合成。这给临床上对于万古霉素治疗效果欠佳的患者更换利奈唑胺，或者应用利奈唑胺效果不满意后更换成万古霉素往往效果比较理想这一现象以理论支持。

经万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺分别诱导后的MRSA菌株与各自诱导前比较发现万古霉素和利奈唑胺的MIC升高2倍、替考拉宁的MIC升高2.67倍，但均未高于4倍。同时据NCLS［6］对于金黄色葡萄球菌对万古霉素、替考拉宁及利奈唑胺的耐药标准，说明经3种药物分别诱导后的MRSA菌株与诱导前比较均未见耐药株的产生，这与Nunes APF等［3］认为体外万古霉素不易诱导耐药及Cazzola M等［10］认为体外利奈唑胺不易诱导耐药的结果是一致的。同时该结果与万古霉素应用于临床半个世纪以来，目前仍是治疗各种严重革兰氏阳性菌感染，特别是MRSA及肠球菌属所致感染的首选药物的临床事实相一致。分析糖肽类不易产生诱导耐药的原因可能与糖肽类抗菌药物除了抑制细菌细胞壁的合成以外，还可以改变细胞膜的通透性及选择性抑制RNA的合成等多种抗菌机制有关。上述结果也解释了利奈唑胺自问世以来一直被视为MRSA感染的治疗有效药物的原因。而恶唑烷酮类抗菌药物不易产生诱导耐药的原因可能与其独特的抗菌机制有关：一方面能抑制mRNA与核糖体的结合，另一方面通过作用于核糖体50S亚基而阻止50S与30S亚基形成70S核糖体。除此之外，也可能与国内临床应用时间短有关。有些学者的研究示经万古霉素诱导后的MRSA少部分转化为h－VISA，故推测上述3种药物未见诱导耐药株的产生也可能与传代数较少有关。

比较3种药物分别诱导前后的变化，P＞0.05说明诱导前后MIC的变化各组间无差别，提示3者诱导产生耐药性无差异。分析其他方面的原因：(1)可能与菌株数量少有关;(2)可能与传代数少有关。但同时发现2号菌株经万古霉素诱导至20代MIC为4μg/mL，至25代为 2μg/mL，分析与抗菌药物选择压力下的MIC不稳定有关。但各对照组除替考拉宁的4号菌株外，经传代后的MIC无变化，说明3种药物对诱导前的MRSA菌株的MIC较稳定。本研究为体外实验，进一步仍需得到临床疗效的验证。

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Comparison on In－vitro Induction of Resistance in M ethicillin－resistance Staphylococcus Aureus to Vancom ycin，Teicoplanin and Linezolid

WANG Yu－ying1，WANG Zhen－shan1，XUE Xin1，NIE Da－ping2
(1.Department of Respiratory Medicine，2.Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China)

［Objective］The paper aims to explore the difference of vancomycin，teicoplanin and linezolid in the inducing resistance of MRSA bymeasuring MIC before and after drug inducing.［Methods］The MIC of Nine MRSA to vancomycin，teicoplanin and linezolid are identified by two－fold agar dilution method，and then two MRSA which are sensitive to the three drugs are found out.The two MRSA are induced separately by vancomycin，teicoplanin and linezolid for 25 generations.At last，the MIC ofMRSA which have been induced to vancomycin，teicoplanin and linezolid are identified.The data is analyzed by SPSS 19.0.［Results］After vancomycin，teicoplanin and linezolid inducing MRSA for 25 generations respectively，the MIC of vancomycin and linezolid increased 2 times and teicoplanin increased 2.67 times compared with those before drug induction.However，there was no difference of the change of MIC among the 3 groups.Additionally，no resistant strainswere generated.The MIC of3 drugs to MRSA strains in control groups in drug－free plates did not change after passage.［Conclusions］The comparison of the three drugs at inducing resistance have no significant difference.

MRSA;vancomycin;teicoplanin;linezolid;inducing resistance

R453.2

A

1671－7295(2012)03－0257－05

2011－12－29;

2012－03－20

王玉颖(1983－)，女，辽宁朝阳县人，硕士研究生。E－mail：wangyuying7890@163.com

王镇山，教授。E－mail：wzsdl@yahoo.com