肝癌患者无水酒精治疗前后外周血IL-6、TGF-β1的变化

栾玉爽，李 航，赵盛发，杨伟萍，丁战玲，李 想

(1航空总医院，北京100021;2广西医科大学附属肿瘤医院)

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤病死率中居第2位［1，2］。其手术切除率仅为10% ～30%，术后5年复发率可高达80%以上［3，4］，成为临床治疗的难题。因此，各种非手术的介入治疗方法成为肝癌综合治疗的一个重要组成部分。超声引导经皮无水酒精注射术(PEI)凭借安全、简便、低廉、容易操作、可重复使用、副作用少等优点成为小肝癌介入治疗的经典方法。但PEI治疗肝癌除了解除患者荷瘤之外对机体免疫方面的影响尚不清楚，而肝癌的发生、发展及预后与宿主的免疫状态密切相关。本研究旨在进一步研究在PEI治疗过程中，肝癌患者外周血T细胞亚群、NK细胞的动态变化，探讨PEI治疗对肝癌患者免疫功能的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2007年11月～2008年12月在广西医科大学附属肿瘤医院接受PEI治疗的原发性肝癌30例(肿瘤直径不超过5 cm，肿瘤数目不超过3个;无门静脉癌栓或下腔静脉癌栓，无肝外转移灶;肝功能按Child分级为A级或B级;血小板计数＞5×109/L及凝血酶原时间 ＜18 s)。其中男23例、女7例，年龄31～78(51.93±11.07)岁，共44个病灶，直径(2.26±0.90)cm。所有患者在接受PEI治疗前和治疗过程中均未接受其他方式的抗癌治疗。另选取正常体检者20例作为对照组，无肝脏疾病及其他部位肿瘤性疾病，男15例、女5例，年龄30～76(53.95±12.54)岁。

1.2 超声引导下PEI ALOKA4000彩色多普勒超声诊断仪，凸阵穿刺探头，探头频率3.5 MHz。无水酒精注射针为日本八光20 G PTC针，长15～20 cm。无水酒精用量参照公式:V=4/3π(r+0.5)3计数，其中V为无水酒精用量，r为肿瘤半径，将计算出的无水酒精量分6～8次注射为1个疗程，每周注射2次，每次注射1～3个病灶，肿瘤最大径≥3 cm时采用多点、多方向穿刺注射，使酒精均匀浸润整个瘤体。

1.3 PEI疗效评价 PEI过程中在超声监视下观察并记录注射无水酒精时肿瘤回声变化情况。疗程结束后行超声和增强CT检查了解肿瘤坏死程度。

1.4 外周血免疫指标的采集 分别在PEI治疗前、治疗第3次后次日、治疗第6次后次日、治疗第8次后次日，采集清晨空腹外周静脉血4 mL注入干燥玻璃管凝固后离心(2 500 r/min，离心10 min)，取血清均分为2管，2管分别编号，密封，置于－80℃冰箱保存，采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清白介素6(IL-6)、转化生长因子β1(TGF-β1)水平。同时对正常对照组检测上述指标。

1.5 IL-6和TGF-β1的测定 IL-6和 TGF-β1按ELISA试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)说明书进行，用酶标仪(上海热电仪器有限公司，Multiskan Mk3)检测OD值，求得标准曲线，计算各孔相应OD值的对应浓度值，最终得出外周血中IL-6和TGF-β1的水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件，无水酒精治疗前后比较采用重复测量方差分析;以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后IL-6、TGF-β1水平检测结果见表1。

2.2 肿瘤坏死程度 PEI疗程结束后所有病例共44个病灶回声均发生了改变，其中呈均匀高回声团的有39个(88.64%);呈不均匀高回声(部分周边有小片状低回声)5个(11.36%)，此5个病灶直径均＞3 cm;原结节内部及周边有血流信号的15个结节经PEI治疗后血流信号全部消失。增强CT检查显示30例患者中24例无残癌和肝内外复发，6例6个病灶增强CT显示有残癌(肿瘤直径为3.00～4.70 cm)。

表1 两组治疗前后IL-6、TGF-β1水平检测结果(±s)

表1 两组治疗前后IL-6、TGF-β1水平检测结果(±s)

注:与对照组PEI术前比较，*P＜0.01;与同组PEI术前比较，◇P＜0.05;与同组PEI术3次后比较，△P＜0.05;与同组PEI术6次后比较，◆P＜0.05

组别 n IL-6(pg/mL) TGF-β1(ng/mL) 0.000 5 0.000 5对照组PEI术前 20 22.66±20.34 31.89±14.97 PEI组PEI术前 30 68.87±53.88* 69.75±21.28* PEI术3次后 30 96.22±56.19◇ 76.40±19.89◇PEI术6次后 25 70.50±27.08△ 65.65±16.23△PEI术8次后 15 51.98±18.03△◆ 63.10±13.30◇△P值

2.3 PEI治疗后并发症 30例肝癌患者在无水酒精注射后出现局部疼痛者11例，无需特殊处理，均可自行缓解;发热者8例，体温均在38℃左右，对症治疗后即降至正常。

3 讨论

目前，PEI治疗肝癌具有创伤小、作用效果可靠、并发症少的优点，已经成为小肝癌的主要治疗方法之一。本研究结果亦说明PEI能有效杀灭肿瘤细胞，降低肿瘤负荷。然而肝癌发生和发展的过程伴随着一系列免疫状态的变化。肝癌术后复发及转移与患者免疫系统功能低下有密切关系。因此，患者PEI术后的免疫功能状况直接关系到肿瘤的复发和患者的预后。

IL-6是一种多效应的细胞因子，能诱导B细胞增殖和分化，促进T细胞的增殖和激活T细胞的细胞毒作用，并且在肝细胞表面有其高亲和力受体，可直接刺激肝细胞的增殖和胶原的分泌［5］。在实验性早期肝癌的发生中，致癌因素引起肝细胞大量坏死，肝脏炎症反应明显，IL-6表达水平明显升高，一方面刺激肝细胞增生，另一方面可刺激肝细胞生长因子大量分泌，有利于肝细胞持续增生而导致肝癌的形成。本研究结果显示，原发性肝癌组患者血清IL-6水平明显高于正常对照组，提示IL-6及其受体的平衡失调会影响机体整个内环境的稳定，进而导致免疫功能的紊乱，直至诱导肝癌的发生发展。然而IL-6不仅能引起肝癌患者免疫功能的紊乱，还能诱导肝细胞及肝癌细胞产生急性期反应蛋白。有人利用H3标记的B细胞系测定急性反应期患者损伤、炎症和感染等血清中IL-6水平，结果是早期IL-6比正常情况下高出2～100倍，表明急性反应期IL-6起着一定的作用。因而IL-6又被认为是机体对创伤、感染等病理过程产生应激反应的有效指标。本研究通过对PEI治疗前后IL-6的检测，发现IL-6在PEI治疗3次后显著升高，可能是因为治疗早期，肿瘤组织凝固坏死少，酒精沿组织间隙和血管外溢较多，造成无水酒精对肿瘤周围肝组织的损伤，使机体对肝组织损伤产生应激反应，而应激状态又是导致机体免疫抑制的因素之一［6］。因此，PEI早期对周围肝组织的损伤可能会导致机体短期内的免疫抑制。而治疗6次后血清中IL-6水平又恢复到治疗前水平，8次后继续下降，说明随着治疗次数的增加，肿瘤组织大部分坏死、纤维化，肿瘤血管不断被栓塞，酒精外溢减少，肝组织损伤也减少，而且正常肝组织具有很强的修复作用，加上适当的保肝治疗，肝功能可迅速恢复，IL-6的表达水平也迅速降低，机体的免疫抑制也得到解除。

TGF-β1是肝脏中主要的负性生长调节因子，正常情况下肝细胞不表达，在人体中TGF-β1作用最强。绝大多数癌症患者血清中均能测到TGF-β1的存在，且显著高于正常人［7］。TGF-β1在机体内是通过自分泌和旁分泌而发挥作用［8］。Ito等研究发现TGF-β1水平与肿瘤血管分布呈正相关。TGF-β1可促进肿瘤血管的形成，使肿瘤生长加速，也能促进细胞外基质的形成并抑制其降解，增加某些蛋白酶的活性，使基质蛋白降解速度加快，提高活性，降低黏着性，增加肿瘤的浸润和转移能力。因此，血清TGF-β1水平可作为评价肝癌治疗效果及预后的指标之一。本研究结果显示，PEI组术前外周血TGF-β1显著高于对照组，与文献报道一致，但PEI治疗3次后TGF-β1较治疗前明显升高，分析其原因可能为:①PEI治疗后肿瘤细胞发生凝固坏死，肿瘤细胞内的大量TGF-β1释放入血，致使血清TGF-β1短期内显著升高;②PEI早期肿瘤组织坏死不彻底，肿瘤细胞的乏氧状态刺激周围存活的肿瘤细胞生物活性，使其分泌更多的TGF-β1入血;③由于PEI早期对正常肝组织的损伤而产生的短期内的免疫抑制。随着治疗次数的增加，肿瘤细胞进一步灭活、肿瘤血管减少，在治疗6次后血清TGF-β1水平就降低至术前水平，在治疗8次后较治疗前继续下降，说明PEI能有效杀伤肿瘤细胞，降低肿瘤负荷，并且能通过降低血清TGF-β1水平等途径，显著降低肿瘤的浸润性，减少肿瘤的转移能力，减少肿瘤的复发。

本研究结果表明，超声引导下PEI能有效杀灭肿瘤细胞，降低肿瘤负荷，同时还能显著改善肝癌患者免疫功能，这将有利于减少肝癌的复发和转移，对肝癌患者的预后起到重要作用。但在PEI治疗早期，可能会因酒精外溢对肿瘤周围肝组织的损伤引起短期免疫抑制。因此我们认为，在无水酒精注射过程中，一定要缓慢推注酒精，防止酒精外溢过多，当随着瘤内压力的增高，推注出现阻力时，可换个方位重新注射。在退针时，先把针推出肿瘤至周围肝组织内，稍停数秒后再把针完全拔出，以减少酒精沿针道的溢出。本研究还发现，肝癌患者免疫功能在PEI 6次或8次后明显升高，提示PEI治疗肝癌疗程应在6～8次以上。本研究中有6例肿瘤直径≥3 cm的病例在PEI治疗后增强CT复查有残癌，其主要原因是直径≥3 cm的肿瘤内部多已形成纤维分隔，无水酒精不易均匀弥散，使PEI局部消融不彻底，因此对于直径≥3 cm的肝癌，可适量延长疗程，并采用多点、多方向穿刺注射。

［1］Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74-108.

［2］He J，Gu D，Wu X，et al.Major causes of death among men and women in China［J］.N Engl J Med，2005，353(11):1124-1134.

［3］Chen MF，Jeng LB，Lee WC.Surgical results in patients with hepatitis virus-related hepatocellular carcinoma in Taiwan［J］.World J Surg，2002，26(6):742-747.

［4］Shimozawa N，Hanazaki K.Longterm prognosis after hepatic resection for small hepatocellular carcinoma［J］.J Am Coll Surg，2004，198(3):356-365.

［5］孔丽，姚树坤，刘金星，等.原发性肝癌患者细胞免疫功能变化及其与转归的关系［J］.中华肝脏病杂志，2005，13(3):194-197.

［6］黎乐群，苏智雄，彭民浩，等.手术打击对原发性肝癌病人术后免疫功能影响的研究［J］.中华肝胆外科杂志，2004，10(6): 420-421.

［7］Ali MA，Koura BA，el-Mashad N，et al.The Bcl-2 and TGF-beta1 levels in patients with chronic hepatitis C，liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma［J］.Egypt J Immunol，2004，11(1):83-90.

［8］Okumoto K，Hattori E，Tamura K，et al.Possible contribution of circulating transforming growth factor-beta1 to immunity and prognosis in unresectable hepatocellular carcinoma［J］.Liver Int，2004，24(1):21-28.