荧光定量PCR检测非小细胞肺癌中MTA1和E-cadherin的表达及意义

梁祥森，陈铭伍，冼 磊

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

MTA1基因是肿瘤转移相关蛋白家族(MTA)的成员之一，通过调控一系列与浸润转移有关的蛋白，在癌细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用，而E-钙黏蛋白(E-cadherin)为钙依赖性黏附蛋白家族中的重要成员之一，是与浸润转移有关的蛋白之一，它在上皮性恶性肿瘤中最重要的生理功能就是抑制肿瘤细胞脱落后发生转移，其表达的缺失或减低可能与人癌细胞的去分化、侵袭性和转移倾向有关。MTA1有可能通过对E-cadherin的调节，从而在癌细胞的侵袭和转移过程中发挥作用。本研究采用实时荧光定量PCR(Q-PCR)联合检测40例非小细胞肺癌(NSCLC)组织、12例癌旁组织、12例良性病变肺组织中MTA1和E-cadherin基因表达的相对水平，分析其表达与临床和组织病理学特征的关系，探讨MTA1和E-cadherin在NSCLC中对肿瘤的发生、侵润、转移方面作用的可能机制，分析二者的关系，寻求一种新而有效的检测方法来提高肺癌的早期检出率，提高患者生存率。

1 材料与方法

1.1 材料 取我院2010年7月～2011年1月手术切除的NSCLC标本40例，所有病例术前未行放疗和化疗;另取其中12例癌旁组织、12例手术切除的良性病变肺组织(6例肺大疱、3例肺结核、3例炎性包块)作为对照，全部标本收集后立即于－80℃冰箱保存，全部标本均经病理确诊。逆转录试剂盒购自Fermentas公司，SYBR Green I荧光染料购自北京天根公司。荧光定量PCR仪为Step one V2.1(ABI公司)。引物由大连宝生物公司设计合成。MTA1(84 bp)F:5'-CAGCTACGAGCAGCACAACG-3';R:5'-TGTCCGTGGTTTGCCAGA-3'。E-cadherin(123 bp)F:5'-AAGTGCTGCAGCCAAAGACAGA-3';R:5'-AGGTAGACCCACCTCAATCATCCTC-3'。内参β-actin(116 bp)F: 5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3';R:5'-GCTAGGAGCCAGGCAGTAATCT-3'。

1.2 方法

1.2.1 提取总RNA 按TRIzol裂解抽提法进行总RNA的提取。通过测 A260值检测 RNA浓度，测A260/A280值检测其纯度。1%琼脂糖凝胶电泳分析其完整性。

1.2.2 RT反应 按逆转录试剂盒提供的方法合成cDNA存放－20℃冰箱备用。

1.2.3 Q-PCR扩增 将PCR产物通过吸附柱式琼脂糖DNA回收方法进行回收纯化，测定其浓度，制备标准品，再以10倍系列梯度进行倍比稀释，获得6个浓度梯度的标准品，依次进行PCR扩增，由仪器软件自动绘制标准曲线。荧光染料SYBR Green I法进行PCR扩增，每份标本重复3次。反应体系20 μL:SYBR Green I 10 μL，10 pmol/μL的引物上、下游各0.4 μL，模板2 μL，ddH2O补足体系。反应条件:95℃预变性2 min，然后95℃ 20 s、60℃ 30 s、68℃ 45 s共40个循环。内参β-actin与目的基因MTA1和E-cadherin反应体系及反应条件均相同。扩增完成后按仪器默认条件进行溶解曲线分析。用2%琼脂糖凝胶电泳分析，PCR产物长度符合目的基因引物设计长度，PCR产物经测序确认与目的基因的目的片段cDNA序列一致。通过PCR扩增曲线判定结果是否是阳性，溶解曲线可判断其特异性，标准曲线产生扩增效率，利用检测到的各个样本MTA1和E-cadherin以及β-actin mRNA相对表达量，标化计算各样本数据，以β-actin mRNA的模板量为参照，分别计算MTA1和E-cadherin mRNA的相对模板数，即:MTA1/β-actin和E-cadherin/β-actin，可依次分别得到每个标本MTA1和E-cadherin相对β-actin的模板数。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析，Q-PCR的计量资料采用±s表示。多组均数比较采用单因素方差分析;两样本均数比较，方差齐时采用两独立样本t检验，方差不齐时行秩和检验。相关性分析用Pearson线形相关检验。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 评价指标 目的基因MTA1和E-cadherin以及内参β-actin的扩增效率经各自的标准曲线自动生成，本实验三基因扩增效率均为R2＞0.995。通过扩增曲线可以看到三者表达情况良好，而且在该反应条件下，三者扩增产物的溶解曲线均只有一个峰，具有很好的特异性，PCR产物均在大于84.0℃以上获得单一溶解峰，确定为目的产物。

2.2 MTA1和E-cadherin在不同组织中的表达比较

MTA1 mRNA在NSCLC组织、癌旁组织、良性疾病组织平均表达水平分别为1.84±1.38、0.91± 0.24和0.56±0.29，MTA1 mRNA在NSCLC组织平均表达水平高于癌旁组织和良性疾病组织(P＜0.05)。E-cadherin mRNA在NSCLC组织、癌旁组织、良性疾病组织平均表达水平分别为9.97± 4.25、11.77±1.91和23.11±3.52，E-cadherin mRNA在NSCLC组织平均表达水平低于癌旁组织和良性疾病组织(P＜0.05)。在癌旁组织和良性疾病组织中MTA1和E-cadherin mRNA的表达无统计学差异(P＞0.05)。MTA1和E-cadherin mRNA表达水平与淋巴结转移及临床分期均有关(P＜0.05)，与患者年龄、性别、吸烟史、病理类型、分化程度等均无关(P＞0.05)，见表1。

2.3 相关性分析 在NSCLC组织中MTA1和E-cadherin mRNA的表达呈负相关(r=－0.561，P＜0.01。

3 讨论

目前未见采用实时荧光定量PCR联合检测MTA1和 E-cadherin mRNA水平的相关报道。大量相应的mRNA存在表达的增加，Q-PCR具有很高的敏感性和特异性，但本试验所检测到的各基因扩增效率并不相等，采用双标准曲线相对定量方法进行检测分析，避免了扩增效率不相等导致的实验误差，该法通过标准曲线获取各基因的扩增效率，用β-actin管家基因作为内参照，以β-actin mRNA模板数作为标尺对实验数据进行标化，利用CT值间接获得目的基因MTA1和E-cadherin mRNA的相对模板数，从而获得目的基因的真实表达水平。该方法可作为一种新而有效的早期检测肺癌指标的实验方法，从而提高肺癌的早期检出率。

表1 MTA1及E-cadherin mRNA表达与肺癌临床特征的关系

MTA1基因可能通过参与信号转导与基因表达，调控一系列与浸润转移有关的蛋白而发挥作用。本实验研究发现MTA1在NSCLC中平均表达水平明显高于癌旁及良性疾病组织，结果与多数报道［1～3］一致，提示 NSCLC中 MTA1的高表达与NSCLC的发生发展呈正相关，MTA1的过度表达高度提示肺癌的发生。同时还发现NSCLC中淋巴结转移组MTA1 mRNA的表达明显高于无淋巴结转移组，提示MTA1过度表达与NSCLC的转移有关［1］。进一步对MTA1与肺癌的进展研究发现，MTA1的表达在Ⅲ期+Ⅳ期明显高于Ⅰ期+Ⅱ期，提示MTA1阳性表达与肿瘤进展及预后有关，晚期患者MTA1的表达水平较早期患者明显升高，相关报道［4，5］亦指出MTA1阳性表达则预后差，生存期短，提示MTA1高表达与肺癌临床分期呈正相关。本试验结果还提示MTA1在NSCLC组织中的表达与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤分化程度、病理类型等无关，与多数文献［1，2，5］一致。但Xu等［6］研究发现在NSCLC中MTA1的表达与吸烟密切相关，本实验未能发现MTA1表达与吸烟的关系，可能与样本例数较少、调查误差及所选择的样本不具有代表性有关，有待加大样本量进一步验证。此外张华等［4］研究发现MTA1蛋白阳性表达率与肿瘤分化程度具有相关性，肿瘤分化程度越低，MTA1蛋白阳性表达率越高。本实验检测的mRNA基于基因水平，而大多数的基因发挥作用是通过蛋白的表达，从mRNA到蛋白中间翻译、修饰的过程中可能造成mRNA/蛋白水平倒置。本实验未能发现MTA1与肿瘤分化程度的相关性，可能与此有关。

E-cadherin与肿瘤的进展、淋巴结转移及预后密切相关。本研究发现E-cadherin在NSCLC中平均表达水平明显低于癌旁及良性疾病组织，结果与多数文献报道［7～9］一致，提示E-cadherin表达的下调或缺失与肿瘤的发生和浸润呈负相关。同时研究发现淋巴结转移组E-cadherin mRNA的表达明显低于无淋巴结转移组，提示E-cadherin缺失或低表达与NSCLC的转移密切相关。亦有报道［7］指出在NSCLC中E-cadherin缺失或低表达似乎可提示淋巴结的微转移。进一步研究发现，E-cadherin mRNA的表达在Ⅲ期+Ⅳ期明显低于Ⅰ期+Ⅱ期，提示E-cadherin缺失或低表达与肺癌临床分期呈负相关，晚期患者MTA1的表达水平较早期患者降低［7］。相关文献［10］指出随着肺癌组织分化程度升高，E-cadherin表达增强，分化越低的肺癌E-cadherin阳性越弱，甚至不表达。而Lin等［11］报道E-cadherin在鳞癌中的表达低于腺癌，提示E-cadherin的异常表达与病理类型有关。本研究未能发现E-cadherin异常表达与肺癌病理类型及分化程度的关系，可能与研究样本量较少和病例的选择不具代表性有关。

MTA1基因通过调控一系列与浸润转移有关的蛋白，从而在癌细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用，而E-cadherin是与浸润转移有关的蛋白之一，其表达的缺失或减低可能与人癌细胞的去分化、侵袭性和转移倾向有关，MTA1有可能通过对E-cadherin的调节发挥作用，但目前未见有关二者相互关系以及调节机制的相关报道。本研究结果提示MTA1和E-cadherin呈负相关，二者相互协调的可能在NSCLC的发生、侵润、转移方面起着重要的作用，但调节机制仍有待于进一步研究。

综上所述，本研究已验证了肺癌组织中MTA1和E-cadherin与肺癌发生发展的密切关系，二者可能存在着负相关。联合检测NSCLC中MTA1和E-cadherin的表达，可用于NSCLC的辅助诊断以及预后评估，但MTA1与E-cadherin之间是否具有调控关系有待于进一步研究。

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