京尼平苷透皮制剂抗炎镇痛作用的研究*

施华平，张 杰，游伟良，曹 维，孙敏捷**

1南京中医药大学基础医学院，南京 210046；2中国药科大学药学院药剂教研室，南京 211198；3国家知识产权局专利局专利审查协作江苏中心，苏州 215011

栀子（fructus gardeniae）是茜草科植物山栀子（Gardenia jasminoides Ellis.）的干燥成熟果实，主产于浙江、福建、江西、湖南、广东，其性寒味苦，归心肺三焦经，具有泄火除烦、清热利尿、凉血解毒之功效[1]。栀子中起到抗炎、活血化瘀作用的有效成分主要为京尼平苷，但对其研究较少，与之形成强烈对比的是，已报道的栀子相关自制制剂治疗软组织损伤的病例多达几千例，足见其疗效的稳定性与重现性。栀子果中栀子苷（geniposide）含量很高（含量可达6%），在栀子的药用效果中起重要作用[2]。京尼平苷是一种环烯醚萜葡萄糖苷 （化学结构式见图1），有报道其具有抗炎、镇痛等作用[3-4]，但是到目前为止，尚未见栀子的有效成分为基础的外用制剂的上市报道。京尼平苷在活血化瘀、消炎止痛方面制成透皮制剂能提高患者的顺应性。本文用栀子的有效成分京尼平苷制备经皮渗透制剂，即制备京尼平苷乳膏和微乳，然后进行镇痛和抗炎作用研究，为栀子的进一步开发利用提供实验基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

电子天平（北京赛多礼斯仪器系统有限公司）；恒温震荡仪（国华电器有限公司）；热板测痛仪GJ-8402型（宁海白石电子医药仪器厂）；鼠耳打孔器；千分尺。

图1 京尼平苷结构式

1.2 材料

京尼平苷 （纯度98%，深圳维琪生物有限公司）；皮炎平（复方醋酸地塞米松乳膏，三九医药股份有限公司）；扶他林（双氯芬酸二乙胺乳胶剂，北京诺华制药有限公司）；聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯 （Solutol®HS 15）、聚氧乙烯醚40氢化蓖麻油（Cremorph RH 40，德国BASF有限公司，分析纯）；二乙二醇单乙醚 （Transcutol P，法国Gattefosse公司，分析纯）；单硬脂酸甘油酯（美国Eastman公司，分析纯）；辛酸/癸酸甘油三酯（GTCC，广州良吉化工有限公司，分析纯）；肉豆蔻酸异丙酯（IPM）、甘油、氮酮（Azone）、醋酸、二甲苯、乙腈、油酸（OA）、丙三醇、异丙醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）。

1.3 实验动物

SD小鼠，雌性或雌雄兼用，体重130～150 g；昆明种小鼠，雌性或雌雄兼用，体重18～22 g（浙江省实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（浙）2008-0033）。

2 方法与结果

2.1 透皮制剂的处方和工艺

2.1.1 乳膏的处方与工艺 处方：Cremophor RH 40 6%、单硬脂酸甘油酯6%、十八醇8%、辛酸癸酸甘油三酯2%、肉豆蔻酸异丙酯6%、油酸2%、甘油10%、氮酮3%、尼泊金乙酯0.3%、京尼平苷占0.5%，加去离子水至100%。

制备工艺 分别按处方量称量油相（单硬脂酸甘油酯、十八醇、IPM、Cremophor RH 40、GTCC、OA、Azone、尼泊金乙酯）和水相（甘油、去离子水），分别置于烧杯中，使油相和水相在80℃水浴中保温，充分搅拌使其溶化，将水相缓缓倒入油相中，边加边匀速搅拌成乳膏状，自然冷却至温度30℃以下停止搅拌。

乳膏的性质 京尼平苷乳膏色泽均匀、质地细腻、渗透性良好、便于涂布，含量为0.5%，稳定性良好，能满足动物实验的要求。

2.1.2 微乳的处方与工艺 处方：Solutol®HS 15∶Transcutol P∶IPM∶京尼平苷水溶液（2∶1∶1∶6）。

制备工艺 将表面活性剂Solutol®HS 15与助表面活性剂按比例混合，然后加入油相IPM中，加热搅拌30 min后，京尼平苷溶于适量水相中，把水相注入其中，搅拌形成澄清透明微乳。

微乳的性质 微乳制剂中京尼平苷含量为0.5%，澄清透明符合要求，能满足动物实验的要求。

2.2 京尼平苷制剂的抗炎、镇痛药效研究

药效学实验主要包括镇痛实验和抗炎实验两部分，以对应临床上的已知效用。分别选取已经在市场上销售，而且具有确切疗效的皮炎平（内含地塞米松）和扶他林（内含双氯芬酸二乙胺）两种外用制剂进行比较。以扶他林作为镇痛实验的阳性对照药物，以皮炎平作为抗炎实验的阳性对照药物。镇痛实验[3-4]采用经典的扭体法和热板测痛法进行考察；抗炎实验采用二甲苯致炎和角叉菜胶致脚趾肿胀进行比较。

2.2.1 对醋酸致痛小鼠的镇痛作用[4-5]参照文献方法。取昆明种小鼠36只，随机分成6组，每组6只。分别为空白组（不含任何基质或者药物）、乳膏基质组（只含乳膏基质）、京尼平苷乳膏组、京尼平苷微乳组、皮炎平乳膏组、扶他林乳胶剂组。根据人体常用推荐剂量（0.05 g/cm2），按体表面积折算出小鼠用量为0.03 g/cm2[6-7]。实验前24 h，用刀片剃去所有小鼠腹部面积约4 cm2的毛。给小鼠涂抹基质或者药物，每次0.12 g，1次/h，共4 h。各组于末次给药30 min后，分别按0.1 mL/10 g体重腹腔注射0.6%的醋酸溶液，立即观察并记录15 min内的扭体次数，计算镇痛率。

结果如表1所示，扶他林乳胶剂组和京尼平苷乳膏组均能极显著减少小鼠的15 min内的扭体次数（P＜0.01），而空白基质对照组小鼠的扭体次数与正常对照组比较无显著性差异，表明京尼平苷乳膏能显著抑制醋酸所致的小鼠疼痛，且其镇痛作用是由药物引起，而不是由乳膏基质产生的。京尼平苷微乳可以抑制醋酸所致的疼痛，与空白组比较具有显著性差异（P＜0.05），皮炎平对醋酸所致的小鼠扭体无明显的抑制作用。

表1 对小鼠扭体次数的影响（±s，n＝6）

表1 对小鼠扭体次数的影响（±s，n＝6）

与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

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2.2.2 热板测痛法[4-5]参照文献方法。取健康昆明种雌性小鼠，实验前于热板测痛仪上测定痛阈值3次（以出现舔后足反应为观察指标），挑选3次平均痛阈值在5～30 s内的小鼠30只，随机分为5组，每组6只。分别为乳膏空白基质组、京尼平苷乳膏组、京尼平苷微乳组、皮炎平乳膏组、扶他林乳胶剂组。于小鼠后足涂药，用药量和用药次数同“2.2.1”。各组末次给药30 min后，分别测定并记录小鼠痛阈值，进行统计分析。

结果如表2所示，扶他林乳胶剂和京尼平苷乳膏均能显著延长小鼠的1 min内的舔足时间，与基质组比较有显著性差异（P＜0.05），而基质组小鼠的舔足时间差与正常对照组比较无显著性差异，反而在给药后，舔足时间有所减少，提示京尼平苷乳膏能显著抑制醋酸所致的小鼠疼痛，且其镇痛作用是由药物引起，而不是由乳膏基质产生的。京尼平苷微乳能够提高小鼠的痛阈，但不具有显著性差异，皮炎平对醋酸所致的小鼠扭体无明显的抑制作用。

2.2.3 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响[8]参照文献方法。取昆明种小鼠36只，随机将小鼠分成6组，每组6只。分别为空白组、乳膏基质组、京尼平苷乳膏组、京尼平苷微乳组、皮炎平乳膏组、扶他林乳胶剂组。于小鼠两耳双面均匀涂赋形剂或受试药物，用药量和用药次数同 “2.2.1”。末次给药后30 min，用适当方法去除空白基质或受试药物。各组小鼠于右耳正反两面涂上二甲苯20 μL致炎，致炎后1 h脱颈椎处死，用直径9 mm打孔器冲下左耳和右耳同一部位的圆片，于分析天平上称重，以两耳片重差值为炎症肿胀度，计算肿胀抑制率，并进行统计分析。

表2 对热刺激所致小鼠疼痛的影响，n＝6）

表2 对热刺激所致小鼠疼痛的影响，n＝6）

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根据结果，如表3所示，皮炎平组和京尼平苷乳膏组均能显著减少二甲苯致小鼠耳廓肿胀的程度（P＜0.05），而空白基质对照组的二甲苯致小鼠耳廓肿胀的程度与正常对照组比较无显著性差异，表明京尼平苷乳膏能显著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀，且抗炎去肿作用是由药物引起，而非乳膏基质产生的。京尼平苷微乳对耳廓肿胀有一定抑制作用，但效果较京尼平苷乳膏差，和空白基质组相比不具有显著性差异，扶他林对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀无明显的抑制作用。

表3 对于二甲苯致小鼠耳肿胀的抗炎作用（±s，n＝6）

表3 对于二甲苯致小鼠耳肿胀的抗炎作用（±s，n＝6）

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2.2.4 对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的影响[8]参照文献方法。取大鼠36只，随机分成6组，每组6只。分别为空白组、乳膏基质组、京尼平苷乳膏组、京尼平苷微乳组、皮炎平乳膏组、扶他林乳胶剂组。据人体常用推荐剂量（0.05 g·cm-2），按体表面积折算出大鼠的用量为0.05 g·cm-2[6-7]。在大鼠右后足涂抹基质适量或受试药物0.1 g，1次/h，共4 h。末次给药后30 min，用千分尺测定每组大鼠右后足正常厚度后，立即于大鼠右后肢足跖皮下注射1%角叉菜胶混悬液0.1 mL/只致炎，分别于致炎后1、2、4、6、8、12 h用千分尺测量大鼠右后足厚度，记录最大肿胀度，计算各剂量组的肿胀抑制率。

结果如表4所示，皮炎平组和京尼平苷乳膏组均能显著减少角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的程度，肿胀抑制率和空白基质组有显著性的差异 （P＜0.05），和抗炎药扶他林接近，而基质组的角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的程度与正常对照组比较无显著性差异，表明京尼平苷乳膏能显著抑制角叉菜胶所致的大鼠足跖肿胀，且抗炎作用是由药物引起，而非基质产生的。京尼平苷微乳可以显著抑制大鼠的足跖肿胀，效果较乳膏剂为好。扶他林对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀无明显的抑制作用。

表4 对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响n＝6）

表4 对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响n＝6）

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3 讨 论

将京尼平苷制成乳膏和微乳以期能显著改善京尼平苷的皮肤透过性，达到透皮疗效。通过对京尼平苷经皮制剂的抗炎镇痛的药效学研究表明，京尼平苷乳膏在抗炎镇痛方面具有确切疗效。在二甲苯致小鼠耳廓肿胀的实验中，作用强于市售皮炎平软膏；在叉菜胶致大鼠足跖肿胀的实验中京尼平苷乳膏和微乳都表现了较强的抗炎作用，并且和市售的皮炎平接近。炎症部位的NO释放增多是导致细胞损伤的重要因素。而核因子-κB（NK-κB）的激活在由γ-干扰素（γ-IFN）刺激引起NO生成的过程中起关键作用。NK-κB的生成主要由IκBs的降解诱导的。京尼平苷作用机理相似于阿司匹林等非甾体类抗炎药，抑制了内源性介质如5-羟色胺、组胺、缓激肽和前列腺素等的释放，能显著抑制γ-IFN引起IκB降解，可通过直接抑制NK-κB发挥抗炎作用，也可通过抑制进一步抑制诱导型NO合酶表达和合成，而间接达到抗炎目的[5]。

京尼平苷微乳也有一定的镇痛的作用，采用经典的扭体法和热板测痛法进行考察，京尼平苷乳膏和微乳都表现了一定镇痛效果，京尼平苷微乳镇痛效果较乳膏剂差，原因可能是微乳流动性强，不易黏着于局部皮肤上，造成药物损失。京尼平苷乳膏镇痛效果与市售的扶他林接近。醋酸引起的小鼠腹膜疼痛和急性炎症，是通过间接引起内源性介质如：5-羟色胺、组胺、缓激肽和前列腺素等的释放，刺激与非甾体抗炎药敏感的痛觉神经，被认为是非选择性疼痛模型，有文献研究证明，京尼平苷阻止了前列腺素的释放[9]，达到镇痛效果。

京尼平苷具有抗炎镇痛作用，将其制备成透皮制剂，使其更好地到达作用部位，但是由于微乳和乳膏的一些差异，京尼平苷乳膏更易黏着于局部皮肤上，能更好地透皮吸收达到抗炎镇痛作用。

通过不同的致炎和致痛实验，表明京尼平苷乳膏对动物具有抗炎镇痛作用，能达到市售的抗炎和镇痛药的效果，在临床用药中更方便有效。京尼平苷透皮利剂的镇痛抗炎作用是确切有效的。

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