优化单纯疱疹病毒DNA疫苗的研究进展

夏 利 程培华 (桂林医学院附属医院皮肤科，广西 桂林 541001)

优化单纯疱疹病毒DNA疫苗的研究进展

夏 利 程培华 (桂林医学院附属医院皮肤科，广西 桂林 541001)

单纯疱疹病毒;HSV-DNA疫苗;生殖器疱疹

单纯疱疹病毒(HSV)是生殖器疱疹(GH)的主要病原体，主要通过性接触传播。HSV感染机体后可长期潜伏在骶神经节中，逃避宿主免疫系统的识别，因而无法彻底清除。在一定条件如应激、疲劳、免疫力低下等情况下，潜伏病毒被激活而发病，其复发率可高达80%。GH易复发、不易治愈的倾向与患者免疫功能紊乱有关，抗病毒联合免疫治疗虽然取得了明显疗效，但是不能有效预防HSV感染，控制潜伏，减少复发。另外，其服药时间长，停药后易复发，加重了患者的经济负担，目前没有能够控制其复发的特效药。研制有效的HSV-DNA疫苗成为防治HSV感染的理想方法。如何优化HSV-DNA疫苗，国内外学者进行了大量的实验研究，并取得了一定进展，但目前仍无一种人用HSV-DNA疫苗面世。本文对近年来优化HSV-DNA疫苗的研究进展做一综述。

1 HSV-DNA疫苗简介

DNA疫苗是伴随现代分子生物学技术的发展而发展起来的新型疫苗，是继第一代减毒活疫苗和第二代亚单位疫苗之后的第三代新型疫苗。DNA疫苗是将编码某种蛋白的外源基因片段克隆到真核表达质粒，再用该DNA免疫动物，抗原编码基因能够在宿主体内表达，并刺激产生针对该抗原蛋白的体液免疫和细胞免疫，以达到预防和治疗疾病的目的。引入的外源基因可以在体内长期存在，并不断表达外源蛋白，持续的刺激机体免疫系统，因此，微量的DNA疫苗即可刺激产生强而持久的免疫应答。HSV感染是一个极其复杂的过程，机体的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫共同参与防御。HSV-DNA疫苗能高效、稳定诱导细胞毒性T淋巴(CTL)效应，并且可以共表达免疫调节因子，根据需要诱导产生最适免疫应答，较其他疫苗更有优势，且安全性更高。加之DNA的易操作性，使HSV-DNA疫苗备受青睐。

包膜糖蛋白参与HSV病毒吸附、入胞、融合、出胞等全过程，是GH发病的关键所在。在已知的11种包膜糖蛋白中，糖蛋白D(Gly coprotein D，gD)是高度保守的蛋白，与其他亚群同源性高，具有同种异株的交叉保护作用。同时gD具有较强的免疫原性，是产生中和抗体的主要糖蛋白，能诱导特异抗HSV抗体产生及活性增强，抑制和中和HSV，从而控制复发。gD是特异性CTL识别位点，可诱导强大的CTL效应。gD具有与天然抗原相同的构象和抗原性，可诱导机体产生全面的免疫应答，因此 HSV-DNA疫苗是目前研究热点。Cooper等〔1〕认为HSV-2gD是制备HSV-DNA疫苗的最佳选择。gD-DNA疫苗免疫豚鼠可产生高滴度的中和抗体，使HSV失活，减少HSV形成潜伏感染的机会，从而有效降低其复发率。

近年来人们开始关注早期表达蛋白(ICP)，并将其作为候选蛋白。Haynes等〔2〕通过HSV-2 ICP27联合大肠杆菌耐热肠毒素(LT)，共免疫小鼠并进行攻击试验，发现可诱导出ICP27特异性免疫反应，并可使小鼠免受致死量HSV-2的攻击。

HSV-DNA疫苗因具有多种优点而备受关注，各种新型HSV-DNA疫苗已经成功构建，并且免疫动物效果也很明显，但其临床试验效果并不如意。国内外学者致力于寻找其原因，并探求优化HSV-DNA疫苗，已取得一定进展。

2 增强疫苗免疫原性

2.1 免疫佐剂 某些物质若先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答，此类物质称为免疫佐剂。将一些编码细胞因子的质粒，如IL-2、IL-12、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSFL)等与DNA疫苗共同转录后可起到免疫佐剂作用，其被体内细胞摄取后表达的免疫刺激因子能够较长时间刺激免疫活性细胞，大大强化了gD蛋白诱导的体液免疫和细胞免疫。

Th1细胞在机体抗HSV胞内感染中发挥重要作用。微环境中细胞因子的种类是影响Th细胞分化的关键因素。在诸多的细胞因子中，IL-12起关键作用，有利于Th0向Th1细胞分化。IL-12可能成为最重要的免疫佐剂。Sin等〔3〕用编码HSV-2gD的质粒与编码IL-12P40和IL-12P35的质粒共注射免疫小鼠，结果发现可诱导出高水平的IgA、IgG和IgE，体液免疫明显增强，同时T细胞增殖实验表明，细胞免疫也明显增强，共注射可显著提高刺激指数。

2.2 CTL表位 以CTL为主的细胞免疫是抗HSV感染的重要组成部分。CTL表位可诱导有效CTL效应，中和HSV颗粒，直接杀伤感染靶细胞，成为特异性细胞免疫重要效应细胞之一。因而，CTL为主的细胞免疫作为优势应答逐渐受到重视。

CTL表位是内源性抗原经APC加工、由MHC分子提呈给TCR的短肽，是介导细胞免疫应答的关键部位，能诱导机体产生强烈的细胞免疫应答，同时也能诱导体液免疫应答〔4〕。杨慧兰等〔5〕构建的pVAX-gD-CTL添加了特异CTL表位基因，并在小鼠体内成功激活出有效的CTL效应，其研究结果表明gD CTL表位的加入明显提高了CTL的活性，促进小鼠Th1介导的细胞免疫应答。

2.3 截短糖蛋白 具有高度免疫原性的HSV-gD-DNA疫苗已经成功构建，并且形成了有效的免疫保护作用，但其临床试验却不足以抵御HSV感染而宣告失败。分析其原因可能是由于gD基因较大(共1 182 bp，编码393个aa)，将其融合到真核表达载体，在体内表达的过程中可能会失去某些抗原表位。为增强HSV疫苗的抗原性，学者们试着去除部分功能性的胞内区和跨膜区的编码基因，同时，在不改变其编码蛋白免疫原性的基础上，尽量对其胞外区进行截短。特别是在目前尚未彻底明确完整抗原蛋白是否对宿主具有毒性或免疫抑制作用的情况下，对抗原进行截短尤为重要。

冯非等〔6〕对完整的gB进行剪切，从HSV SM44株基因组中扩增出HSV-gBt编码基因，其含有去除了部分N基端的信号肽序列和部分胞外区基因组序列，把该目的基因插入到真核表达载体pcDNA3中，成功构建出重组质粒pcDNA3-gBt。截短的糖蛋白已被证实具有明显的免疫效果。

2.4 模拟抗原表位 随着噬菌体随机肽库展示技术的诞生，学者们开始试着模拟gD的抗原表位，并试图将其作为新型的候选抗原。于爱莲等〔7〕从噬菌体随机肽库中筛选针对HSVgD单克隆抗体的基因，在11个阳性克隆序列中，有9条含有2个同源性较高的氨基酸序列，即PYH-H和P-PLW，认为这2个氨基酸核心骨架可能是HSVgD的模拟抗原表位。抗原表位有线型构象和模拟表位两种，利用针对HSV-2gD的单克隆抗体(McAb)从随机肽库中筛选出相应的模拟抗原表位骨架序列。

这些模拟抗原表位不需要预先确定抗原蛋白质的氨基酸序列〔8〕。但其免疫原性及其诱导抗体产生的免疫保护效应还有待进一步验证。若能找到基因序列短，免疫原性高的替代抗原，则可谓之找到了一个新型有效的候选抗原。将多个模拟抗原表位同时克隆在同一载体中构建多表位复合疫苗，将为HSV-DNA疫苗提供更有效更广阔的发展前景。

2.5 多表位复合疫苗 将多个抗原基因导入同一载体中构建多表位复合疫苗，可大大增强疫苗的免疫原性，从而诱导出强大的免疫保护作用。对HSV的抗原性及抗原表位的深入研究，使多表位复合疫苗成为可能。Domingo等〔9〕对gD和gB复合疫苗的研究结果表明，gD/gB共同免疫刺激机体产生的保护效果要优于单一糖蛋白免疫的效果。单一抗原表位疫苗用于防治HSV感染具有一定的局限性，多表位复合疫苗可能是最为理想的疫苗。

徐金华等〔10〕将 HSV-2疫苗的主要候选糖蛋白 gD、gB、gC和早期表达蛋白ICP27基因融合，成功构建了HSV-2多表位复合疫苗，用其免疫小鼠可诱导产生HSV-2特异性IgG和IFN-γ，且CTL活性增强。

3 增强机体反应性

3.1 接种方式 在影响DNA疫苗免疫效果的诸多因素中，接种方式起着关键作用。DNA疫苗通常首选肌肉注射，由于肌肉组织是分化的终末细胞，将外源DNA整合到细胞基因组DNA的可能性很小，故该途径免疫效果不佳。HSV-DNA疫苗接种效率还有待提高。为增强疫苗的导入效率及其随后诱导的免疫效应，学者们试图用各种接种途径来探究其免疫诱导效应。

有科学家用HSV-2gD经不同途径免疫豚鼠，比较发现阴道内接种对豚鼠的免疫保护作用最强〔11〕。徐金华等〔10〕研究结果表明用脂质体包裹质粒比裸质粒肌肉注射免疫小鼠能显著提高其免疫活性。Jazayeri等〔12〕报道，经足底皮下注射(pcDNA3-gD2)免疫小鼠较肌肉注射的免疫效果更好。HSV-DNA疫苗免疫接种途径较灵活，目前尚未达到统一。

3.2 表达载体 DNA疫苗是病原体的保护性抗原基因和载体的重组质粒。HSV-DNA疫苗的研究不断有新突破，国内外学者也分别成功构建了不同表达载体的重组质粒。PcDNA3.1具有真核启动子pcmv，能够高水平表达下游蛋白，是构建DNA疫苗常用的表达载体。在此基础上，Invitrogen公司成功研制了真核表达质粒pVAX1。不仅能高水平表达目的基因，同时还含有卡那霉素抗性基因的特性，目前已经广泛用于DNA疫苗研制。但目前为止世界上仍没有一种合适于人用的HSV-DNA疫苗，因为目前构建DNA疫苗的载体质粒通常含有氨苄青霉素抗性基因，其副作用较大，不符合人用DNA疫苗载体的安全标准。何方等〔13〕已成功去除了真核表达质粒载体pcDNA3中的氨苄青霉素抗性基因，构建了含Kan抗性的真核表达质粒载体pcDNAKan，为新型HSV-DNA疫苗的构建奠定了基础。

3.3 联合免疫 国内外学者正在探索新的DNA疫苗方法，如DNA疫苗联合免疫，核酸/蛋白的联合免疫等。Fotouhi等〔14〕用pcDNA3-gD2免疫小鼠，再有gD2蛋白加强免疫一次，结果显示联合免疫效果比单独用DNA疫苗或蛋白疫苗免疫两次要显著增强。

安全性分析将外源性抗原重组质粒DNA整合到宿主细胞DNA中，首先要考虑的一个重要问题是安全性。于芳等〔15〕用不同剂量pcDNA3-gB(100，300，500 mg/L)免疫小鼠后，分别检测各组小鼠的血液生理学，血液生化学指标以及8个重要组织器官的病理学(心、肝、脾、肺、肾、角膜、脑和三叉神经节)，结果各项指标均无明显变化，与对照组(生理盐水组)相比无显著性差异，初步说明pcDNA3-Gb是安全的。

4 展望

HSV感染激发的细胞免疫应答倾斜漂移于Th2介导的体液免疫，即发生了免疫逃避，使得HSV病毒不能有效清除，从而潜伏于神经节。Th1/Th2平衡失调越严重，GH患者复发就越频繁。因此能否有效诱导Th1型免疫应答是评价HSV-DNA疫苗效果的重要指标。优化HSV-DNA疫苗的最终目标是诱导机体产生高水平的Th1型细胞免疫，同时应增加T细胞库中特异性CTL细胞的数量。多表位复合DNA疫苗有很好的应用前景。无论是DNA疫苗本身还是免疫佐剂，其免疫效应都随着免疫途径和剂量的不同而不同，这些将有待进一步研究和改进。一旦明确其影响效应，将有助于DNA疫苗的优化，增强其实用性。同时也要考虑HSV-DNA疫苗是否存在免疫耐受、基因突变、非目的基因编码蛋白的副作用。

1 Cooper D，Mester JC，Guo M，et al.Epitope mapping of full-length glycoprotein D from HSV-2 reveals a novel CD4+CTL epitope located at the transmembrane-cytoplasmic junction〔J〕.Cell Immunol，2006;239(2)：113-20.

2 Haynes JR，Arrington I，Dong L，et al.Potent protective cellular immune responses generated by a DNA vaccine ending HSV-2 ICP27 and E.coli heat labile enterotoxin〔J〕.Vaccine，2006;24(23)：5016-26.

3 Sin JI，Kim JJ，Boyer JD，et al.In vivo modulation of vaccine-induced immune responses toward a 7 h phenotype micreasea potency and vaccine effectiveness in a herpes simplex virus type 2 mouse model〔J〕.J Virol，1999;73(1)：501-9.

4 Van Hall T，Laban S，Koppers-Lalic D，et al.The varicellovirus-encoded TAP inhibitor UL 49.5 regulates the presentation of CTL epitopes by Qalbl〔J〕.J Immunol，2007;178(2)：657-62.

5 杨慧兰，周 翠，关 蕾.单纯疱疹病毒Ⅱ型CTL表位DNA疫苗的Th1/Th2免疫应答研究〔J〕.中国皮肤性病学杂志，2007;21(7)：402-4.

6 冯 非，贺 冰，孟祥俊.单纯疱疹病毒Ⅰ型截短糖蛋白B基因序列的克隆及鉴定〔J〕.中国眼耳鼻喉科杂志，2009;9(1)：11-3.

7 于爱莲，焦凤萍，王 玉.用噬菌体随机12肽库筛选单纯疱疹病毒Ⅱ型gD基因模拟抗原表位的研究〔J〕.中国现代医学杂志，2008;18(9)：1194-6.

8 Wang LF，YU M.Epitope indentification and discovery using phage display libraries：application invaccine development and diagnostics〔J〕.Curr Drug Targets，2004;5(1)：1215-9.

9 Domingo C，Gadea I，Pardeiro M，et al.Immunological properties of a DNA plasmid encoding a chimeric protein of herpes simplex virus type 2 glycoprotein B and glycoprotein D〔J〕.Vaccine，2003;21(25-26)：3565-94.

10 徐金华，许 炎，郑志忠.脂质体转染对HSV2多表位复合DNA疫苗诱导小鼠特异性免疫应答的影响〔J〕.中国皮肤性病学杂志，2008;22(3)：143-5.

11 Bernstein DI.Effect of vaccination with vaccinaia virus expressing HSV-2 glycoprotein D on protection from genital HSV-2 infection〔J〕.Vaccine，2000;18：1351-8.

12 Jazayeri M，Soleimanjahi H，Fotouhi F，et al.Comparison of intramuscular and footpad subcutaneous immunization with DNA vaccine encoding HSV-gD2 in mice〔J〕.Comp Immu Microbiol Infect Dis，2009;32(5)：453-61.

13 何 方，洪 艳，陈 勇.一种新型单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗的构建及其初步研究〔J〕.中国卫生检验杂志，2008;18(6)：997-9.

14 Fotouhi F，Soleimanjahi H，Roostaee MH，et al.Enhancement of protective humoral immune responses against Herpes simplex virus-2 in DNA-immunized guinea-pigs using protein boosting〔J〕.FEMS Immu Med Microbiol，2008;54(1)：18-26.

15 于 芳，贺 冰，邱 俊.单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B核酸疫苗安全性的初步评价〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2008;34(5)：806-9.

R373

A

1005-9202(2012)06-1317-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.06.109

广西自然科学基金(2010GXNSFA013249)

程培华(1959-)，男，主任医师，教授，主要从事皮肤病毒性及真菌性疾病研究。

夏 利(1986-)，女，硕士，主要从事皮肤病毒性及真菌性疾病研究。

〔2011-03-30收稿 2011-09-21修回〕

(编辑 张 慧)