畜禽免疫的研究进展及其疫苗发展策略

孙百明，刘红梅，祁克宗，崔尚金

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001；2.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036)

疫苗免疫接种是控制畜禽传染病的重要手段之一，通过使用疫苗产生的保护性免疫应答可以使被免疫动物免受病原体的攻击。但一些畜禽主要病原体，如猪瘟病毒、新城疫病毒的疫苗免疫常常失败。有些疫苗能够提供短期保护，却不能使机体产生免疫记忆；有些疫苗能够使机体产生免疫记忆，却不能使机体产生针对抗原的有效免疫保护；强烈的免疫反应并不一定确保能够形成有效的保护性免疫，如呼吸道感染常导致保护性免疫失效；许多疾病以综合征的形式危害动物，如猪呼吸与繁殖综合征等。

同时，在规模化、集约化的养殖环境中，畜禽对疾病越来越易感，是因为畜禽本身遗传抗性变弱了，还是存在其它未知因素，尚不清楚。实际上，畜禽对疾病易感原因是复杂的，使用疫苗产生的保护性免疫应答，不仅是抗原特异性的结果，更是体内外环境各种因素、各种因子相互作用、相互影响的综合结果。免疫系统的有效性和完整性在动物疾病防控中的作用十分关键，如何进一步理解宿主、病原微生物、体内外环境3者之间的关系以及如何使机体产生稳固的免疫应答是一个非常重要的问题。

1 宿主免疫应答的完整性

1.1 天然免疫 天然免疫是抗病原体感染的第一道防线，是机体在暴露于病原后和特异性免疫反应建立之前的最重要防御阶段。参与天然免疫的细胞通过胚系编码的一系列模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRR)识别病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，实现对外来病原体的早期识别，进而启动天然免疫的效应机制[1]。

PRR主要有3类：可溶性识别分子(如C型凝集素家族成员)、跨膜识别分子(如Toll样受体 Toll-like receptor，TLR)、胞内识别分子(如NOD样受体)；表达PRR的免疫细胞主要是单核/吞噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞(Dendritic cells，DCs)和自然杀伤细胞(Naturalkiller cells，NK)。

PAMP包括不同的生物信息标志，例如，G-菌的脂多糖(LPS)、G+菌的肽聚糖、RNA病毒的dsRNA、细菌DNA中未甲基化的CpG寡聚DNA，以及各种病原体表面结构中的末端糖基等。

天然免疫系统的PRR识别PAMP的过程称为模式识别作用。例如，C型凝集素中的猪源SP-A可识别流感病毒血凝素的唾液酸受体；TLRs可识别病毒颗粒或DNA、dsRNA和ssRNA等，因此，PRR对PAMP的识别不仅暗示了感染的存在，还提供了与入侵病原体类型相关的基本信息，模式识别作用的这种特性使天然免疫系统可以选择对某一病原最有效的效应机制[2]。

PRR识别PAMP后，将激活各种不同的细胞内信号传导途径，产生各种效应机制以及种类繁多的效应分子：一是产生活性氧、活性氮以及各种抗微生物肽如防御素系列，它们对宿主直接发挥保护作用；二是产生细胞因子、粘附分子、急性相蛋白(Acute phase proteins，APPs)，它们参与炎症和机体早期防御反应以及随后的获得性免疫；三是产生共刺激分子B7.1和B7.2，它们与T细胞表面的CD28结合，作为T细胞活化的第二信号[3]。

总之，通过研究机体各类PRR的分子特征、免疫功能及其信号传导机制，将进一步揭示机体对抗病原体的天然免疫反应，为畜禽传染病的防治提供新的思路。

1.2 获得性免疫 目前，有关动物获得性免疫应答的理论非常丰富。获得性免疫具有高度的特异性,其基础是抗原受体的识别特异性。巨噬细胞通过模式识别受体介导病原体相关分子模式；而T、B淋巴细胞通过TCR和BCR介导抗原识别模式，例如T淋巴细胞免疫识别的首要步骤是TCR识别由DCs呈递的抗原肽-MHC分子复合物，对这两个分子相互作用的认识可以指导疫苗的设计研究。如在多肽疫苗、重组疫苗和DNA疫苗的分子构建中，就应依据DCs对抗原肽的摄取降解，与MHC分子的结合，以及形成肽-MHC分子复合物后，再与TCR分子特定结合过程是否能够有效激活T细胞反应的基本要求来进行[4]，因为符合上述条件的疫苗抗原能够被免疫系统有效、完整、快速地识别。

体液免疫的效应系统是B淋巴细胞系统，在病原体感染及疫苗应用过程中，B淋巴细胞所产生的抗体的变化、消涨、类型以及保护性，是衡量感染转归及疫苗效果的重要指标。资料表明，B淋巴细胞表面的抗原受体主要从3个途径共同或分别介导抗原信号而激活B淋巴细胞：一是接受DCs的，与MHC分子共同呈递的抗原信号；二是同时接受Th细胞的信号；三是直接接受单独的抗原信号[4]。

在病原进化压力下，机体获得性免疫反应系统逐步形成了两个最关键的特点：一是免疫球蛋白基因家族重排以适应外部侵入的多形性抗原；二是形成免疫记忆。基因重排是产生抗体多样性的基础，免疫记忆是疫苗产生持续免疫能力的基础。对于免疫接种，值得强调的是，在第一次免疫后，持续的保护性免疫完全依赖于抗原特异性免疫记忆的形成，激活的特异性免疫细胞所在的体液环境对特异性免疫应答具有决定性的影响。因此，有效的抗原特异性提呈是免疫成功的前提。现已明确机体内主要的抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells，APC)是DCs，它在非特异性摄取抗原、处理抗原、呈递抗原以启动并调节特异性免疫应答方面有着极其重要的作用，研究DCs在对不同类型疫苗抗原的选取、设计以及具体效果的分析等方面将有助于疫苗的设计和研发[3-4]。

1.3 天然免疫与获得性免疫的关系 一般认为特异性免疫应答仅是非特异性免疫应答的延续；免疫记忆是T、B淋巴细胞所介导的获得性免疫应答的独有特征,而天然免疫一直被认为没有免疫记忆。研究表明，天然免疫系统的细胞和体液成份除了其本身固有的功能外，还可通过下述作用引导和启动获得性免疫：如降低抗原刺激阈，提供共刺激信号，决定获得性免疫对抗原的选择性并决定其应答类型[5]。例如，DCs主要通过PRR识别众多病原体中共有的、保守的PAMP而在天然免疫中发挥作用。DCs除了单纯的抗原捕获、递呈和对T细胞的协同刺激作用外，在特异性激活幼稚T细胞、联结天然免疫和获得性免疫反应中起着桥梁作用[5-6]。然而一些病原体却可通过破坏DCs的PRR功能得以进化，继而逃避宿主免疫监视。因此，有必要研究病原微生物与其相关受体的相互作用机制，以制定抗感染的策略。

TLRs是近年研究的热点，作为天然免疫中重要的PRR，通过与PAMP的模式识别作用诱导免疫效应分子表达，激活多种前炎性因子参与抗感染过程。TLRs与PAMPs的结合还可以增强APC的抗原呈递功能，促进细胞膜表面共刺激分子(如B7分子)和MHCⅡ类分子表达，直接促使Th细胞活化，参与并调控特异性免疫应答的启动[7]。

NK细胞是天然免疫系统的核心成员，具有早期识别、清除病毒感染和肿瘤细胞等功能。近年研究发现，NK细胞是通过一些受体来识别MHCⅠ和Ⅱ类样分子，初次活化后具有获得性免疫细胞的特征，即免疫记忆功能[8-9]，其产生的机制及其调控机制尚不清楚。但毫无疑问，NK细胞的记忆功能在机体抵御病原体入侵时扮演重要角色，也颠覆了传统免疫学的观念，对深入理解天然免疫与获得性免疫之间的关系提供了新信息。

2 病原微生物的进化适应性

当宿主在利用各种免疫机制阻止和控制被感染、发病时，病原微生物也通过基因突变、基因水平转移、肠道移位等方式，逃避宿主免疫系统的识别和清除，完成其物种进化。

2.1 基因突变 基于自然选择和宿主免疫系统的选择压力即免疫选择，病毒利用其基因中序列突变的多样性，即抗原漂移和抗原转移进行免疫逃避。病毒基因突变包括转换、插入、缺失、颠换、重组、重配等，最典型的例子为A型流感病毒，流感病毒属RNA病毒,在复制过程中，RNA聚合酶缺乏校正功能,各基因均存在一定程度的点突变，由一连串渐进的点突变构成抗原漂移；随着点突变逐渐积累,将直接导致抗原发生改变，产生新型的流感病毒，这种变异即抗原转移[10]。

流感病毒的基因组分为8个节段，当两个不同来源的病毒共同感染同一宿主时，就可能产生重配病毒,这种现象称为基因重配。当基因重配涉及到HA和NA亚型时,就会使流行株出现新的亚型[11]。

抗原转移和基因重配也有可能使病毒跨越种属屏障，并以较快的速度分化变异，维持生存，从而使其感染的宿主范围不断扩大[12]。同时，病毒对新宿主的适应过程也是病毒自身进化的过程。

2.2 基因水平转移 与基因突变一样，基因水平转移也是促使物种进化的途径之一。基因水平转移是不同物种之间或细胞器间基因的交换，是相对于常规的从亲代到子代的基因垂直转移而提出的，它打破了亲缘关系的界限，使基因能够在不同的物种之间进行交换[13]。

基因水平转移可以通过插入、重组与细胞中的原有基因整合等方式，产生具有新功能的基因，从而加快物种演化速度。基因水平转移现象普遍存在于生物界，尤其是原核生物。资料表明，在抗生素环境压力下，出现了大量抗药性病原菌，用基因突变的说法很难解释清楚，实际上，这与抗药性基因的水平转移有关。不仅如此，非致病菌在向致病菌进化过程中,获得外源毒力基因从而表现出对宿主具有的致病性的表型，往往也是基因水平转移的结果[14]。研究表明，在细菌毒力基因水平转移过程中，一系列可移动的染色体外遗传元件起着重要作用,如质粒、转座子和噬菌体等[15]。其中，研究较热门的细菌毒力岛形成原因之一，极可能是细菌基因水平转移的结果。

目前，已知参与水平转移的基因大多与细菌的抗药性和致病性有关。无论是耐药性基因还是毒力基因的水平转移，都是细菌对宿主或环境的一种适应方法，这种适应方式为细菌生存开辟了更多的空间，增加了细菌的多样性，能够有效与宿主细胞发生作用而形成侵染。

2.3 病原体移位 1966年Wolochow首先使用“bacterial translocation”一词，即细菌移位。原意为存在于肠腔内的细菌和(或)内毒素，通过某种途径越过肠粘膜屏障，进入肠系膜淋巴结、门静脉系统，继而进入体循环以及肝、脾、肺等远隔器官的过程[16-17]。但细菌移位并不意味着肠源性感染，移位的细菌首先被肠系膜淋巴结截获，其结果取决于机体防御机制和细菌毒力之间的力量对比。因此，细菌发生肠道移位的3个基本病理要素是肠道细菌微生态平衡的紊乱、肠粘膜屏障功能的破坏以及机体免疫功能的损伤[18]。

此外，研究表明，促发肠道细菌移位的诱因还有两大因素：一是内毒素。内毒素可激活肠黄嘌呤氧化酶及氧自由基等，损伤肠粘膜的通透性，使肠粘膜对细菌和大分子物质的通透性增强[19]。内毒素是G-菌细胞壁成分中的LPS，当菌体死亡崩解后被释放出来。抗生素可消灭菌体，但无法破坏内毒素。由于内毒素的存在，使病理过程继续向前推延，也是临床发生继发感染进而形成混合感染的原因之一。二是抗生素，长期大剂量使用抗生素致使肠道正常菌群失调，条件性致病菌(如大肠杆菌)和其他优势增殖的细菌便有可能突破受损的菌膜和粘膜屏障而移位。

不仅细菌存在移位情况，一些病毒也存在移位情况，如猪呼吸道冠状病毒。猪呼吸道冠状病毒为猪传染性胃肠炎病毒的一个变异株[20]，由于养猪生产中广泛使用益生菌、酸制剂等添加剂，病毒在肠道局部生存压力增大，进而转移到宿主的防御系统相对薄弱部位——呼吸道，通过移位的方式由肠冠状病毒演变而成呼吸道冠状病毒。未来是否还会演变成其他病毒变异株，无法预料。

2.4 其他免疫逃逸 病原体逃避宿主抗感染反应的机制还有很多。一些病原体可通过潜伏形式存在于宿主细胞内或整合于细胞DNA中逃避宿主的免疫清除，进而形成持续性感染，如马立克氏病毒潜伏感染在宿主细胞内，条件适宜时，被感染的T细胞发生转化形成肿瘤细胞；一些病原体寄生在免疫细胞中逃避杀伤，如PRRSV感染巨噬细胞，呈递外源性抗原能力降低，致使机体延迟产生保护性抗体或其他免疫因子；还有一些病原体通过其编码产物，拮抗、阻断和抑制宿主的免疫反应得以长期潜伏生存。

总之，深入研究病原体免疫逃逸机制将有助于理解机体高度复杂的免疫应答和免疫调节机制，对疫苗开发、基因导入载体疫苗设计等提供思路。

3 内外环境的影响

稳态指机体内环境中各种理化因素保持动态平衡的状态，借助神经－体液系统的调节，机体各系统、器官、组织细胞之间的活动得以相互协调。稳态是机体健康的标志。近年来，免疫畜禽频频出现非典型猪瘟、非典型新城疫等现象，原因常与畜禽中流行株的带毒率和病毒载量较高有关，表明机体的内环境处于非稳态。

导致免疫失败和机体致病，不仅仅是病原体与机体两者之间的相互作用，外部生态环境因素也参与这一过程。畜禽和病原体均生活于生态环境中，因此对疾病的认识不应只考虑机体与病原体之间关系的变化，而忽视导致这种变化背后的生态环境因素，如畜禽呼吸道疾病的发生往往与集约化、高密度生产引发低劣空气质量有关；食用霉变饲料和应激因素可引发免疫抑制，使畜禽处于亚健康状态，这也是降低疫苗效力的主要原因之一。

此外，病原体与其群落外部生态环境的改变，也将影响对宿主的感染和致病，如基因水平转移广泛存在于不同的生态系统中，其中环境因素在基因水平转移的过程中扮演重要的角色。研究发现在自然环境中已经存在大量具有转化活性的DNA分子和能主动摄取外源DNA的感受态细胞，这引起人们对滥用抗生素以及使用医用抗生素作为饲料添加剂所带来的安全性更深层次的思考。然而，人们对环境中基因转移的速率、环境因子对基因转移的影响却知之甚少[21]。

因此，疫苗开发的重点应当从目前只考虑抗原特异性向抗原特异性和体内外环境综合考虑转变，这必定是今后发展的新方向。

4 策略

基于宿主、病原体、环境3者对机体免疫应答的影响，就疫苗开发和疫苗免疫而言，除了常规的研制思路和免疫过程，还需要从以下3个方面加以重视。

4.1 从基础免疫学研究中寻找疫苗研制的突破口 疫苗诞生极大促进了免疫学的发展，反过来，免疫学基础研究的进展又推动疫苗的研制。随着基因组学、蛋白质组学、抗体组学、抗原表位组学及系统生物学等前沿学科与疫苗学研究的交叉和渗透，畜禽多种病原基因组序列的测定、抗原表位的筛选、病原体的致病机理和机体防御机制等逐渐被人们所认识。

在传统的减毒疫苗和灭活疫苗的基础之上，结合基因工程、蛋白质工程、细胞工程、发酵工程等现代生物技术，陆续发展了蛋白疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗以及抗原表位依赖性疫苗；同时，疫苗传递方式、疫苗佐剂和免疫调节剂的研究又推动了疫苗的有效性和较少的副作用。

值得注意的是，尽管在口蹄疫病、猪蓝耳病、猪圆环病等重要传染性疾病的研究中已发现了多种抗原，但采用这类抗原制作的疫苗常不能取得较好的免疫保护。为获得真正有效疫苗，不仅有赖于鉴定和克隆能诱导免疫应答的抗原，还有赖于测定和评估其抗原能否诱发免疫保护并探讨其分子和细胞生物学机制。因此，重要传染病疫苗的相关基础免疫学研究是发展疫苗并有效控制传染病最关键的环节之一[22]。

因此，立足基础免疫学的理论发展前沿，熟悉病原体的致病机制，包括免疫保护、免疫病理以及免疫逃逸机制，才能更好地建设大规模高通量的疫苗筛选体系与研究平台，研制拥有自主知识产权的新型安全高效疫苗及其评价监测体系。

4.2 细胞因子和APPs的监测 体液是细胞生活的内环境，体液变化反应机体的机能状态。在疾病感染早期，机体启动非特异性免疫反应，这一阶段局部组织细胞或体液中可检测出细胞因子的表达，如干扰素、肿瘤坏死因子、白介素等，这些因子在局部组织或整个系统发挥免疫调节作用：激活中性粒细胞和巨噬细胞的抗菌活性，调节血管内皮细胞和淋巴细胞粘附因子的表达水平，诱导APPs的表达等[23-24]。

APPs是机体在感染、炎症、组织损伤等应激原的刺激下短期内合成的多种血浆蛋白质的总称，如C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、触珠蛋白(Haptoglobin，HP)、血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid-A，SAA)、α1-酸性糖蛋白(α1-acid glycoprotein，AGP)等。研究表明机体内APPs水平与疾病感染、炎症损伤、免疫等因素密切相关,因此,APPs不仅可用于动物健康状态的评价，还可以将其作为畜禽疾病诊断、预防和控制的重要检测指标[25-26]。

畜禽处于亚健康状态或亚临床感染往往不易引起人们的注意，因此疫苗免疫之前，通过检测细胞因子和APPs，以确定机体的机能状态以及天然免疫情况，对确定是否接种疫苗和接种时间至关重要。资料表明，猪感染PRRSV后，血清中HP、CRP、SAA和猪主要急性相蛋白(Pig-main acute phase protein，Pig-MAP)等 APPs浓度发生显著变化[27]，对这些蛋白的检测有助于了解机体的健康状态，对免疫接种的实施和风险评估具有重要意义。

目前，已经有多种APPs用于作为评价疾病状态的生物学指标，如牛HP的检测已经成为巴氏杆菌病、奶牛乳房炎、口蹄疫等疾病的重要诊断依据[28-29]；猪HP和CRP等组合蛋白的检测分析也成为一个令人关注的领域[30]。

当然，对于不同动物的细胞因子和血清APPs的阈值还需试验加以确定，并研究其具体的评价指标。作为评价感染性疾病的炎症标志物-细胞因子和APPs，因其比血液学指标具有更强的敏感性与特异性，将可能成为预测畜群传染病发生率的有效手段。

4.3 重视生态环境因素的影响 病因学知识告诉我们，内因是发病的根据，外因是发病的条件。外因包括圈舍、饲料、饮水、环境条件、环境生物等，例如许多疫苗在实验室阶段免疫效果很好，有的动物保护率甚至达到100%，用到田间试验保护率却下降，除了与免疫动物有关外，与生态环境因素不无关系。当机体与大多数病原微生物之间相互制约达到相对平衡，畜禽常常不发病或没有临床症状；而一旦发病，往往多是不良的环境因子所致。因此，对疫苗的使用应注意环境因素的作用，因为有时环境因素甚至通过影响病原而对疾病发生起着决定作用，如呼吸系统疾病的广泛流行乃至疫苗免疫失败多与畜禽的生活环境有关。

5 结论

综上所述，疫苗免疫效应发挥不仅仅需要机体免疫系统的有效性和完整性，还与病原进化适应性以及体内、外环境各种因素有关。只有全面理解宿主、病原体、环境三者在畜禽发病时的相互作用关系，从基础免疫学研究中寻找疫苗研制的突破口，才能有助于疫苗的开发；在疫苗免疫之前，增加对机体细胞因子和APPs的监测，重视生态环境因素对疫苗效果的影响将是对现行疫苗免疫策略的一个有益补充。

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