非小细胞肺癌VEGF-C的表达及LYVE-1标记的微血管密度与淋巴结转移的关系

刘东华 (内蒙古医科大学附属医院保健中心，内蒙古 呼和浩特 010050)

肺癌的发病率和死亡率居恶性肿瘤的首位，淋巴结转移是导致患者无法手术彻底切除和预后差的最重要原因之一，但其发生机制仍不清楚。

血管内皮生长因子(VEGF-C)是与肿瘤淋巴管生成和淋巴转移相关的重要因子。研究表明，肿瘤患者表达的VEGF-C与肿瘤的淋巴结转移密切相关。本研究旨在探讨NSCLC患者VEGF-C蛋白的表达及内皮透明质酸受体(LYVE-1)标记的微血管密度与淋巴结转移的关系及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2008年6月至2009年12月本院手术治疗的56例NSCLC组织作为研究对象，所有患者均经过病理学检测，手术前均没有进行化疗或者放射性治疗。56例NSCLC患者中男39例，女17例，年龄36～74〔平均(56.25±10.48)〕岁。根据国际抗癌联盟制订的NSCLC TNM 分期:Ⅰ期9例，Ⅱ期4例，Ⅲ期21例(包括Ⅲa期18例以及Ⅲb期3例)，Ⅳ期为2例。病理类型:鳞癌24例，腺癌29例，大细胞癌3例。所有患者进行淋巴结转移分析，其中43例有转移，13例未出现转移。对照组10例均为肺良性病变，男7例，女3例;年龄32～75〔平均(51.13±8.26)〕岁;肺大疱3例，肺错构瘤2例，肺外伤6例。

1.2 免疫组化染色 所有患者的病变组织首先进行石蜡包埋，然后进行5 μm连续切片，再行HE以及免疫组织化学染色。VEGF-C单克隆抗体以及LYVE-1单克隆抗体(羊抗人)均购自美国R＆D，VEGF-C、LYVE-1表达水平的分析采用免疫组化试剂盒(购自北京中杉公司)。LYVE-1和VEGF-C石蜡切片分别采用柠檬酸缓冲液以及EDTA缓冲液进行高温修复。最后用DAB显色，苏木精进行复染。

1.3 结果判定 免疫组织化学染色分析VEGF-C蛋白应位于肿瘤细胞及巨噬细胞的胞质中，呈棕黄色颗粒。结果判定按Mattern法〔1〕:根据细胞染色强度和染色细胞所占面积积分之和来判断。染色强度积分:不染色=0;轻度染色(淡黄色)=1;中度染色(黄色)=2;强染色(棕黄色或黄褐色)=3。染色面积积分:无细胞染色=0;＜25%细胞染色=1;25% ～50%细胞染色=2;＞50%细胞染色=3。两种积分之和≥3分者为表达阳性;≤2表达阴性。LYVE-1蛋白主要存在于淋巴管内皮细胞的胞质中，呈棕黄色颗粒。LMVD计数根据Wendner的方法进行〔2〕，即:先在低倍镜下对整个切片进行分析，寻找血管最为密集处，然后再在高倍镜下对染色的淋巴血管进行计数，分别选取4个视野计算血管数量，然后求平均值即为LMVD。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0进行统计分析。计量数据采用±s表示，组间比较采用t检验，计数资料进行χ2检验。

2 结果

2.1 VEGF-C、LYVE-1在病变组织的表达情况 NSCLC患者病变组织中VEGF-C蛋白表达阳性者为76.79%(43/56)，明显高于肺良性病变组织30.00%(3/10)(P＜0.05)。LYVE-1在10例良性肺病变及56例NSCLC病变组织中均呈阳性，LYVE-1阳性血管主要分布于肿瘤边缘，在肿瘤内部较少。LYVE-1阳性染色淋巴血管腔壁较薄，由单层内皮细胞组成，具有毛细血管的特点;内皮细胞的胞质中含有大量棕黄色的阳性颗粒，血管管腔内偶尔会出现瘤栓，但是没有红细胞。NSCLC组织中MLVD(11.19±1.54)较肺良性病变组织LMVD(6.05±1.26)增多(P＜0.05)。

2.2 VEGF-C表达与LYVE-1标记淋巴管密度的关系 VEGF-C表达阳性组MLVD(11.62±2.15)显著高于LEGF-C阴性组 MLVD(9.76±1.36)(n=13，P＜0.05)。

2.3 VEGF-C表达与淋巴结转移、PTNM分期的关系 NSCLC伴淋巴结转移者VEGF-C蛋白阳性率为95.45%(21/22)，无淋巴结转移者VEGF-C阳性率为67.65%(23/34)，差异有统计学意义(P＜0.05)。VEGF-C蛋白在Ⅰ期+Ⅱ期NSCLC患者中的阳性率为63.64%(21/33例)，在Ⅲ期+Ⅳ期NSCLC患者中的阳性率为100%(23/23)，两组差异显著(P＜0.05)。

3 讨论

淋巴管转移是NSCLC常见且主要的扩散途径，是影响NSCLC患者预后的重要因素。目前认为，淋巴管生成受淋巴管生成因子及其受体的介导和调控。VEGF-C是淋巴管内皮生长因子，其是VEGF家族成员之一，其受体为VEGFR-3，VEGF-C与其受体结合后激活下游的信号通路进而促进淋巴管内皮细胞大量增殖和增生;同时，VEGF-C被水解后可转化为其成熟形式，可激活VEGF-2进一步激活血管以及淋巴管内皮细胞。目前研究显示，VEGF-C高表达肿瘤淋巴血管的形成以及密度，进而促进了肿瘤的淋巴转移，因此认为其过表达与肿瘤患者的预后关系密切〔3～5〕。本研究结果显示，NSCLC组织中VEGF-C的表达水平显著高于肺良性病变组织，说明VEGF-C的过表达与NSCLC的发生以及进展有密切关系。在正常组织中，VEGF-C及其受体处于失活状态，而在病理状态下NSCLC细胞自分泌VEGF-C，促进肿瘤淋巴管的形成，进而促进肿瘤发展。

LYVE-1是一种膜蛋白，主要分布于淋巴管内外腔表面。目前研究显示，LYVE-1在人和鼠正常以及肿瘤组织的淋巴血管中呈特异性表达〔6〕。汪源等〔7〕研究显示，无论正常组织还是肿瘤组织的淋巴管内皮细胞中LYVE-1均表达阳性。本研究结果显示，肿瘤组织中LYVE-1的表达水平显著高于肺良性病变组织。VEGF-C表达阳性的组织中，MLVD显著高于阴性组织。提示NSCLC细胞通过自分泌产生VEGF-C，与其受体结合激活下游信号通路促进淋巴管形成，淋巴管数目增多使癌细胞接触淋巴管的机会增多，由于淋巴管缺乏紧密连接和连续的基底膜，肿瘤细胞易于从内皮细胞间隙进入淋巴管，从而促进肺癌淋巴结转移。另一方面，VEGF-C可作为一种趋化因子活化淋巴管，诱导淋巴内皮细胞分泌趋化因子及类似物，趋化肿瘤细胞进入淋巴管，有利于肿瘤细胞通过间质液的流动被动转运到淋巴管，发生淋巴转移。VEGF-C表达增高、淋巴管密度增加是促使NSCLC发生淋巴结转移的重要原因。本研究结果提示VEGF-C过表达促进了肿瘤淋巴结转移以及预后不，与肿瘤的恶性程度明显相关。通过抑制肿瘤细胞自分泌VEGF-C或者阻断VEGF-C以及下游的信号通道，可抑制肿瘤淋巴血管的形成，并降低淋巴结转移的发生率，对患者的预后有着重要意义。

1 Mattern J，Koommagl R，Voim M.Biological characterization of subgroups of squamous cell lung carcinomas〔J〕.Clin Cancer Res，1999;5(6):1459-63.

2 郑亚民，达明绪，赵紫罡，等.胃癌癌周微淋巴管密度与肿瘤侵袭转移的相关性研究〔J〕.华西医学，2006;21(2):269-71.

3 Hirakawa S，Brown LF，Kodama S，et al.VEGF-C induced lymphangiogenesis in sentinel lymph nodes promotes tumor metastasis to distant sites〔J〕.Blood，2007;109(3):1010-7.

4 Karkkainen MJ，Haiko P，Sainio K，et al.Vascular endothelial growth factor C is required for sprouting of the first lymphatic vessels from embryonic veins〔J〕.Nat Immunol，2004;5(1):74-80.

5 Yonemura Y，Endo Y，Tabata K，et al.Role of VEGF-C and VEGF-D in lymphangiogenesis in gastric cancer〔J〕.Int J Clin Oncol，2005;10(5):318-27.

6 Vainionpaa N，Biitzow R，Hukkanen M，et al.Basement membrane protein distribution in LYVE-1 immunorcactive lymphatic vessels of normaltissues and ovarian carcinomas〔J〕.Cell Tissue Res，2007;328(2):317-28.

7 汪 源，潘铁成，陈 涛.非细胞肺癌(NSCLC)的LYVE-1阳性微淋巴管密度与肿瘤淋巴转移的关系〔J〕.现代肿瘤医学，2009;17(7):1243-5.