大孔吸附树脂纯化桑黄总黄酮工艺

孙锦秀

桑黄(Phellinus vaninii Ljub)属担子菌亚门(Basidiomcota)，层菌纲(Hymenomycetes)，多孔菌科(Polyporaceae)，木层孔菌属(Phellinus)［1］。最新研究表明，桑黄具有抗肿瘤、抗炎、抗血管生成活性等多种药理作用［2-4］，主要含有可溶性多糖、三萜和黄酮等活性成分［5］，是少有的含有活性黄酮化合物的药用真菌。桑黄总黄酮成分是其抗氧自由基的主要活性部位［6］，目前对桑黄总黄酮分离纯化的系统研究很少。本文应用大孔树脂对桑黄总黄酮进行纯化富集，优选最佳工艺条件。

1 实验仪器和材料

1.1 主要仪器 KQ-250B超声波清洗仪(昆山市声仪器有限公司)，R2000旋转蒸发仪(德国Buchi公司)，UV-2401紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，D100B恒流泵(上海青浦沪西仪器厂)。

1.2 试药 桑黄(杨树桑黄)，延吉市长白山特产经营部;芦丁对照品(含量≥98%)，南京泽朗植提有限公司，批号:ZL20111108;AB-8大孔吸附树脂(含酯基的苯乙烯聚合物，非极性)、D101大孔吸附树脂(苯乙烯聚合物，非极性)、NKA-9大孔吸附树脂(苯乙烯聚合物，极性)，天津南开和成化工有限公司。

2 方法与结果

2.1 桑黄总黄酮粗提物的制备 准确称取15 g桑黄子实体粉末(过60目筛)，置烧瓶中，加70%乙醇450 mL，室温下浸泡 12 h后，超声提取30 min，抽滤，残渣再超声提取1次，合并2次滤液，浓缩烘干，得到桑黄醇提物粗品。

2.2 含量测定

2.2.1 溶液配制 对照液:准确称取芦丁对照品25 mg，70%乙醇溶解定容至50 mL;AlCl3液:含水AlCl31.8 g，70%乙醇溶液定容至100 mL;样品液:准确称取桑黄醇提物17.3 mg，70%乙醇定容至25 mL。

2.2.2 标准曲线 精密吸取对照液0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL，置50 mL量瓶，分别加AlCl3液4.0 mL和去离子水15 mL，70%乙醇定容，30℃水浴10 min，室温放置20 min后，408 nm处测吸光度。得线性回归方程:A=0.026 3 C+0.009 7 (r=0.999 8)，芦丁浓度在8～40 μg/mL范围内线性良好。

2.2.3 样品总黄酮含量测定 精密吸取样品液1.5 mL，同“2.2.2”项下操作，桑黄粗提物中总黄酮含量为464.5 mg/g。

2.3 纯化工艺考察

2.3.1 树脂预处理 取一定量树脂，95%乙醇溶剂浸泡24 h，湿法装柱，95%乙醇洗脱，控制流速，洗至流出液与水1∶2混合不产生浑浊后，水洗至无醇味，3柱体积(BV)的3%盐酸溶液浸泡3 h，用水洗至中性，再用3 BV的3%氢氧化钠溶液浸泡3 h，水洗至中性。

2.3.2 树脂的选择 精密称取 D101、AB-8、NKA-9树脂各5.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入总黄酮含量为2.064 mg/mL的桑黄粗提物溶液(C0)45 mL，置摇床室温下振摇24 h，取上清液，测其总黄酮含量(C1)。取出吸附饱和的树脂，吸干表面水分，加70%乙醇45 mL，室温下振摇24 h，再取上清液，测其总黄酮含量(C2)。以饱和吸附量和解吸率为考察指标，观察各树脂的吸附性能。饱和吸附量Q=(C0-C1)×V/W，W为树脂质量(g);解吸率(%)=C2/(C0-C1)×100%。结果见表1，选择AB-8为桑黄粗提物的纯化树脂。

表1 三种大孔树脂的吸附性能比较

2.3.3 pH值对吸附的影响 取5.0 g预处理的AB-8大孔树脂置于 50 mL具塞锥形瓶中，加2.064 mg/mL桑黄粗提物溶液45 mL，用盐酸或者NaOH调节溶液pH值分别为4、5、6、7、9。室温下振荡24 h。取上清液测定总黄酮含量，计算室温下的树脂静态吸附量。见图1。

图1 pH值对树脂饱和吸附率量的影响

由图1可见，pH为5时，树脂静态饱和吸附量最大，可能由于桑黄中的黄酮类化合物为多羟基酚类，呈弱酸性，在酸性条件下呈分子状态，以氢键方式被吸附，酸性过强，黄酮类化合物易生成烊盐，使吸附效果变差;碱性增大则使酚羟基上的氢解离形成酸根离子，树脂的结合减弱，从而使吸附量降低。桑黄醇提物溶液pH值介于5和6之间，因此，本实验不另加缓冲盐。

2.3.4 上样浓度考察 称取0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 g桑黄总黄酮粗提物，用70%乙醇30 mL超声溶解，加水稀释至100 mL作为上柱液，计算总黄酮含量(C0)。AB-8大孔树脂50 g湿法装柱(φ 2.4 cm，300 mm，径高比1∶10)，分别用1 BV去离子水和5 BV 70%乙醇洗脱，乙醇洗脱液浓缩后定容至100 mL，测总黄酮含量(C2)，计算洗脱率，洗脱率(%)=C2/C0×100%，见图2。

图2 上样浓度考察

由图2可见，上样浓度较小时，效率较低，由于死吸附等损耗，使洗脱率降低;当上样浓度达到5 mg/mL(黄酮含量2.323 mg/mL)时，变化很小。浓度越大越容易出现沉淀，导致柱层析堵塞，使流速变慢，所以选择上样浓度为5 mg/mL。

2.3.5 泄露曲线 取粗提物浓度5 mg/mL上柱液上柱，每10 mL收集1个流份，于378 nm波长处测吸光度。见图3。

图3 AB-8大孔树脂的动态吸附泄漏曲线

从图3可见，上柱液量少时，流出液吸光度较小;当上柱液达到30 mL时，桑黄黄酮开始出现泄漏，随着流出液体积的增加，流出液的吸光度逐渐增大。当流出液体积增至100 mL时，达到吸附平衡，流出液吸光度不再发生变化。

2.3.6 洗脱剂浓度考察 取粗提物浓度5 mg/mL上柱液100 mL上柱，1 BV去离子水洗，再分别用5 BV的30%、50%、70%、90%乙醇溶液洗脱。洗脱液浓缩干燥后称重，测定总黄酮含量，计算得率:得率(%)=上柱的粗提物的重量/纯化后的质量。见表2。表2显示，90%醇洗脱所得总黄酮含量高，但得率较低;70%醇洗脱黄酮含量与90%醇洗脱接近，但得率较高。综合考虑，70%醇为最佳洗脱剂浓度。

表2 洗脱剂浓度影响

2.3.7 流速考察 取粗提物浓度5 mg/mL上柱液100 mL上柱，1 BV去离子水洗，再以5 BV 70%乙醇洗脱，恒流泵控制流速分别为1、2、3 BV/h。洗脱液浓缩干燥后称重，计算得率。分别为73.23%、70.72%、62.18%。流速越慢洗脱越完全;过快会减少被吸附物质和树脂的接触时间，进而影响吸附效果，洗脱不完全;而流速过慢，会延长生产周期，同时滞留在树脂中的杂质较多，再生困难，缩短树脂使用寿命。综合考虑选择流速2 BV/h。

2.3.8 树脂再生 AB-8大孔树脂每使用一次后，用95%乙醇洗至无色，然后用水洗去乙醇即可使用。但多次反复使用后，树脂颜色变深，吸附量下降，所以树脂使用数次后必须再生:3 BV 3%盐酸溶液浸泡3 h，用水洗至中性，再用3 BV 3%氢氧化钠溶液浸泡3 h，水洗至中性。

3 讨论

3.1 桑黄总黄酮提取物紫外扫描的最大吸收峰在378 nm，加 AlCl3络合后最大吸收峰移至408 nm，提高了专属性。

3.2 根据上述结果，大孔树脂纯化富集桑黄总黄酮的最佳工艺:AB-8大孔树脂50 g湿法装柱(φ 2.4 cm，300 mm，径高比1∶10)，5 mg/mL桑黄粗提物溶液100 mL上样，1 BV水洗后以5 BV 70%乙醇洗脱，流速2 BV/h，乙醇洗脱液干燥浓缩得到精制桑黄总黄酮。

［1］ 戴玉成，图力古尔.中国东北野生食药用真菌图志［M］.北京:科学出版社，2007:164-166.

［2］ Huang HY，Chieh SY，Tso TK，et al.Orally administered mycelial culture of Phellinus linteus exhibits antitumor effects in hepatoma cell-bearing mice［J］.Journal of Ethnopharmacology，2011，133(2):460-466.

［3］ Kim BC，Choi JW，Hong HY，et al.Heme oxygenase-1 mediates the anti-inflammatory effect of mushroom Phellinus linteus in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages［J］.Journal of Ethnopharmacology，2006，106(3):364-371.

［4］ Lee YS，Kim YH，Shin EK，et al.Anti-angiogenic activity of methanol extract of Phellinus linteus and its fractions［J］.Journal of Ethnopharmacology，2010，131(1):56-62.

［5］ 郑立军，王清，季俊虬，等.药用真菌桑黄的研究进展［J］.现代中药研究与实验，2005，19(3):60-64.

［6］ Shon MY，Kim TH，Sung NJ.Antioxidants and free scavenging activity of phellinus baumii(Phellinus of hymenochaetaceae) extracts［J］.Food chemistry，2003(82):593-597.