苜蓿黄酮的研究进展及其在鸡生产中的应用

湖南农业大学动物科学技术学院 陈佩佩 占今舜 闫景彩＊

黄酮类化合物是苜蓿中主要的生物活性成分之一，具有抗氧化清除自由基的作用，可以作为天然抗氧化剂。苜蓿黄酮还具有抗肿瘤、提高机体免疫力、延缓衰老、增强心血管功能，以及微量雌激素样作用。本文就苜蓿黄酮的分类、含量影响因素、提取方法和生物学功能及其在禽生产中的应用作一综述。

1 苜蓿黄酮的分类

苜蓿黄酮是苜蓿生长中形成的一类次生代谢产物，主要存在于苜蓿的茎叶中。苜蓿属中的黄酮类成分约有80余种，来源于紫花苜蓿的有30余种，据报道苜蓿属植物的黄酮类成分主要有以下几种结构类型：黄酮及其苷类、黄酮醇及其苷类、异黄酮类、异黄烷、查耳酮、二氢黄酮、二氢异黄酮和紫檀烷类等（何春年等，2006）。苜蓿属中黄酮类成分的母核主要为芹菜素、木犀草素、苜蓿素、金圣草黄素、美迪紫檀素山奈酚、槲皮素、杨梅黄素、芦丁、燃料木黄酮、刺芒柄花黄素和大豆素等。其中芹菜素、木犀草素、苜蓿素、金圣草黄素、刺芒柄花黄素、槲皮素、燃料木黄酮和美的紫檀素等母核的结构均存在于紫花苜蓿中，并以芹菜素、木犀草素、苜蓿素最为常见。

2 影响苜蓿黄酮含量的因素

2.1 品种间的差异 由于自身的遗传特性及对环境的适应性的不同，不同苜蓿品种间在总黄酮含量上也表现出比较显著的差异。薄亚光等（2008）对6个紫花苜蓿品种茎、叶中总黄酮进行提取和测定，结果表明，各品种、株系总黄酮含量有差异，其中品种牧歌三叶型总黄酮含量最高，为7.08 mg/g，品种全能三叶型含量最低，为6.32 mg/g。徐文燕（2007）考察不同品种和采收季节紫花苜蓿中黄酮含量，结果表明，品种和采收季节对紫花苜蓿中的总黄酮含量均有明显影响，并且不同品种中的总黄酮含量对季节变化的敏感性不同。

2.2 环境因素对苜蓿黄酮含量的影响 植物的次生代谢产物是其在长期的自然存在中选择、变异和适应的结果，因此次生代谢产物的合成会受到环境因素的调控。目前研究表明，影响苜蓿黄酮合成的环境因子主要包括光照、温度、CO2浓度、矿物质营养和土壤水分等几个因素。

光照和温度是两大影响因素，可以直接影响到黄酮合成途径中关键酶的活性，对植株中黄酮含量有明显的调节作用。高光照、较低的平均温度可以使黄酮类成分合成途径中相关酶的活性大幅度提高，从而有利于黄酮类物质的积累，故夏季植株中黄酮含量高于春季，在夏季收割提取为宜。CO2浓度是间接影响因素，主要通过影响黄酮类物质前体的数量来影响其合成。矿物质元素是作物生长所必需的，适量限制氮、磷肥的施用有利于黄酮类成分的积累。Strisse等（2005）研究报道，高氮降低苹果叶片中总黄酮含量的机制在于使L-苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性下调，从而影响下游黄酮的合成。Stewart等（2001）对不同施肥状态下的番茄进行了检测，结果显示，限制氮肥后，黄酮醇含量在番茄叶片中显著增加；限制磷肥后黄酮醇含量在果实发育初期显著增加。

3 苜蓿黄酮的提取、测定及分离方法

3.1 提取方法 目前苜蓿黄酮的提取方法，主要有索式提取法、有机溶剂浸提法、热水浸提法、碱提酸沉法等几种方法。

有机溶剂提取法是提取苜蓿黄酮的理想方法，常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等，高体积分数的醇（90%～95%）适于提取苷元，体积分数60%左右的醇适合提取苷类（张研等，2008）。邢军等（2008）利用乙醇提取苜蓿黄酮，通过单因素和正交试验，确定乙醇提取苜蓿总黄酮的最佳条件为：浸提剂选用70%乙醇，料液比为1∶50，浸提温度为80℃，浸提时间为4 h，浸提次数为2次。

但传统的有机溶剂提取法耗时相对较长，近年来，超声波辅助提取法和微波辅助提取法广泛应用于植物天然有效成分的提取，是很有发展前景的方法。邓斌等（2009）研究发现，在乙醇浸提的基础上，采用超声波辅助技术提取苜蓿黄酮，萃取时间短、溶剂用量少、提取效率高、重现性好。冯涛等（2008）对苜蓿黄酮采用了加热回流、索氏提取、超声提取3种提取方法，结果发现，超声提取法提取黄酮可显著提高黄酮得率，最佳提取工艺为：60%乙醇，30∶1 的液固比，提取 3 次，1 h/次。 张咏梅等（2008）采用微波辅助提取法提取苜蓿黄酮，结果表明，最佳提取工艺为：体积分数为40%乙醇，固液比为1∶30，微波500 W功率下作用60 s。3.2 测定方法 黄酮含量的测定方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法、纸色谱PC和薄层色谱TLC法、荧光测定法、原子吸收光谱法、近红外漫反射光谱法、共振散射光谱法、薄层扫描法和单扫示波极谱法等，其中最常用的就是紫外分光光度法和高效液相色谱法 （董彩军和李锋，2010）。

紫外分光光度法是以芦丁为标准样品，在其紫外最大吸收峰510 nm处测定试样的吸光值与标准曲线比较并定量计算苜蓿黄酮含量。丛媛媛等（2006）采用紫外分光光度法测定了苜蓿黄酮的含量，结果表明，该方法重现性好，操作简单，平均加样回收率为96.2%，相对标准偏差为3.32%。紫外分光光度法可以定量的计算苜蓿中总黄酮的含量，但是此方法前处理复杂，需要对样品进行纯化。

高效液相色谱法具有分离效果好、准确性高、分析速度快，以及仪器自动化程度高等特点，尤其适合对挥发性低、热稳定性差、分子量大，以及离子型化合物的分析，已广泛用于植物天然活性成分的分析。徐文燕等（2007）利用高效液相色谱法同时测定出苜蓿中几种主要黄酮成分：芹菜素、苜蓿素和7，4’一二羟基黄酮。李存满等（2006）采用高效液相色谱法测定苜蓿中苜蓿素的含量，较好的色谱条件为：色谱柱为Agilent Zorbox C18，流动相为甲醇-水（65∶35），流速为 0.8 mL/min，检测波长为349 nm，进样量为5 μL，温度为室温。

3.3 分离方法 关于黄酮类化合物的分离纯化方法有很多，主要有薄层层析法、柱层析法、纸层析法、超临界CO2萃取法和大孔树脂吸附法等（宋秋华等，2007）。

大孔树脂是近年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，是依靠其和被吸附的分子（吸附质）之间的范德华引力，通过其巨大的比表面进行物理吸附而工作的。其具有物化稳定性高、吸附选择性好、不受无机物存在的影响、再生简单、解析条件温和、使用周期长、易于构成闭路循环及节省费用等优点，广泛用于物质的分离纯化。朱宇旌等（2008）采用大孔吸附树脂HPH480对苜蓿异黄酮进行纯化，动态吸附试验结果表明，较好的动态吸附条件为：上样液浓度0.6～1.2 mg/mL，上样液pH 为 5，径高比为 1∶20，预吸附 4 h，流速 2 mL/min，上样液温度40℃，采用体积分数80%的乙醇60℃洗脱，流速为1.0 mL/min，洗脱剂用量为4 BV（床容积），在此条件下得到的苜蓿异黄酮纯度可在10%以上，较粗提物提高3倍以上。

4 苜蓿黄酮的生物学功能

4.1 抗氧化 朱宇旌等（2006）在猪油中加入不同比例紫花苜蓿黄酮粗提物，结果表明，添加苜蓿黄酮粗提物对猪油具有良好的抗氧化作用，但不如维生素C效果好；另外，维生素C和维生素E对苜蓿黄酮粗提物具有明显的协同抗氧化作用，效果优于单独添加黄酮粗提物和维生素C。李宝兰等（2009）研究报道，灌胃苜蓿总黄酮的小鼠全血中的甘油三脂和低密度脂蛋白的含量明显降低（P＜0.05），而高密度脂蛋白胆固醇含量升高；小鼠的肝脏和肾脏组织匀浆中过氧化物歧化酶的活性显著升高（P＜0.05），丙二醛含量降低。这说明苜蓿总黄酮具有降血脂、降低低密度脂蛋白胆固醇、预防和减缓动脉硬化的作用，同时还具有抑制氧自由基损伤防止脂质过氧化的作用。黄酮类化合物抗氧化及消除自由基的机理主要包括两个方面：一是络合那些具有氧化作用的金属离子，形成螯合物，从而降低金属的氧化作用；二是能和自由基进行反应，从而消除某些自由基的氧化作用（郑裕国等，2003）。

4.2 提高免疫力 吴健全等（2005）研究报道，苜蓿中的染料木黄酮可以提高辐射小鼠的免疫功能，在Csy射线照射试验中，供给0.08%染料木黄酮的小鼠与正常小鼠比较，淋巴细胞增殖指数提高86.8%，血清溶血素含量提高90.9%，同时脾脏功能也有很大提高。这可能与染料木黄酮强烈抑制促癌剂TPA诱导的多形核细胞及HL-60细胞中H2O2的形成，并中等强度地抑制HL-60细胞中超氧阴离子自由基的产生有关。

4.3 抗肿瘤 Boue等 （2003）在乳腺癌细胞MCF-7增殖化验中发现紫花苜蓿甲醇提取物表现出了超过雌二醇的雌激素活性，可以诱导具有抑制细胞增殖作用的基因的表达。余小平等（2005）用 5 μmol／L的染料木黄酮处理乳腺癌细胞后，癌细胞中血管内皮生长因子的mRNA和蛋白表达水平逐渐下降，表明染料木黄酮能在转录和翻译水平上降低乳腺癌的发病率。Wang等（1999）体外试验研究表明，芹菜素对白血病细胞株HL-60具有抑制生长和诱导凋亡的作用。Fotsis等（1997）研究发现，芹菜素可通过抑制肿瘤细胞分泌的促进血管生长的bFGF（碱性成纤维生长因子）活性降低其对血管内皮细胞的刺激作用。Cai等（2005、2004）研究报道，在突变型 Apcmin鼠4～18周龄期间的饲粮中添加0.2%的苜蓿素，与对照组相比，患肠癌的机率降低了33%，进一步的试验还发现苜蓿素可以抑制恶性胸腺癌细胞MDA-MB-468的生长。

4.4 类雌激素作用 研究证实苜蓿的雌激素作用活性，主要与其所含的异黄酮化合物有关。异黄酮化合物可以结合到雌二醇激素受体上，发挥雌激素样作用，可以作为辅助治疗用于低雌激素状况，预防和治疗骨质疏松。苜蓿含有3种主要的植物雌激素：香豆雌酚、燃料木黄酮和forrnonetin，两种次要的为大豆黄酮和biochaninA。香豆雌酚活性相当于雌二醇的5%，燃料木黄酮和forrnonetin分别为 1%和 0.01%（Noteboom，1963）。大豆黄酮、染料木黄酮等异黄酮可缓解去卵巢小鼠骨质疏松和脂肪代谢失调（Uesugi等，2001）。

5 在鸡生产中应用

熊小文等（2012）研究饲粮中添加苜蓿黄酮提取物对崇仁麻鸡母雏生长性能和养分利用率的影响，结果表明，苜蓿黄酮提取物在一定程度上提高了崇仁麻鸡母雏平均日采食量、鸡只的体重和日增重，并在第15～21 d达到显著水平；降低了料重比，提高养分利用率；降低粗脂肪的利用率，提高钙的利用率。说明日粮中添加适量的苜蓿黄酮提取物，能够促进鸡的生长，降低脂肪的沉积，改善胴体品质，提高生产效益。周萍芳（2011）研究结果表明，在鸡的日粮中添加含有黄酮300 mg/kg的苜蓿黄酮提取物，能够降低麻鸡血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、尿素氮和尿酸含量，提高高密度脂蛋白胆固醇含量；降低腹脂率、皮下脂肪厚度、肌间脂肪宽度和胸肌和腿肌中脂肪含量，提高胸肌和腿肌中蛋白质含量；提高脾脏指数和法氏囊指数。说明日粮中添加适量的黄酮提取物可以提高麻鸡的生产性能，提高营养物质的代谢率，降低血脂，提高胴体品质，降低腹脂率，改善免疫功能。另外，有研究表明，在肉仔鸡的日粮中添加600 mg/kg的苜蓿素可以提高肉仔鸡的生长性能，提高饲料转化率（佟建明等，2004）。

6 小结

苜蓿属植物资源丰富，分布范围广。但目前对苜蓿资源的利用主要以干草或草粉的形式作为畜禽饲料，少部分经加工后作为饲料添加剂应用，对苜蓿中的活性物质如黄酮的研究、开发和利用较少，仅局限于实验室，不能用于大规模生产。随着研究的不断深入，生产技术的不断成熟，相信苜蓿黄酮将会作为饲料添加剂广泛应用于动物生产中。

[1]薄亚光，贾志宽，韩清芳.多叶型与三叶型紫花苜蓿地上部总黄酮含量的比较[J].西北农业学报，2008，17（4）：129 ～ 132.

[2]丛媛媛，帕丽达·阿不力孜，赵文惠，等.紫外分光光度法测定紫花苜蓿黄酮的含量[J].时珍国医国药，2006，17（3）：363.

[3]董彩军，李锋.黄酮类化合物的研究进展[J].农产品加工.2010，2：65~69.

[4]邓斌，王存娥，刘志伟，等.超声波提取紫花苜蓿中黄酮类化合物的工艺研究[J].江苏农业科学，2009，1：257 ～ 258.

[5]冯涛，边瑞环，唐然肖，等.苜蓿总黄酮提取及含量测定研究[J].时珍国医国药，2008，19（10）：2382 ～ 2383.

[6]何春年，李展，高微微，等.苜蓿属植物的黄酮类化学成分研究概况[J].中国药学杂志，2006，41（8）：565~568.

[7]李宝兰，张咏梅，卢小康，等.苜蓿总黄酮对小鼠脂类代谢及氧氧自由基的影响[J].草业科学，2009，26（8）：93 ～ 96.

[8]李存满，李兰芳，张勤增.高效液相色谱法测定苜蓿中苜蓿素的含量[J].药物分析杂志，2006，26（4）：494 ～ 496.

[9]宋秋华，张磊，梁飞，等.黄酮类化合物提取和纯化工艺研究进展[J].山西化工，2007，27(4)：24~27.

[10]佟建明，萨仁娜，单之玮，等.首草素对肉仔鸡和仔猪生产性能的影响[J].中国畜牧兽医，2004，31（2）：19~21.

[11]吴健全，金宏，许志勤，等.染料木黄酮对γ射线损伤小鼠免疫功能的影响[J].解放军预防医学杂志，2005，23（4）：245 ～ 247.

[12]徐文燕.紫花苜蓿化学成分及其黄酮成分影响因子的研究：[硕士学位论文][D].北京：中国协和医科大学，2007.

[13]熊小文，周萍芳，丁君辉，等.苜蓿草粉和苜蓿黄酮提取物对崇仁麻鸡母雏生长性能和养分利用率的影响[J].江西畜牧兽医杂志，2012，3：30～33.

[14]邢军，张瑞，李友广.新疆紫花苜蓿中黄酮类色素的提取研究[J].食品工业科学，2008，3：186~188.191.

[15]余小平，糜漫天，朱俊东.染料木黄酮对MDA-MB-453乳腺癌细胞VEGF 表达的影响[J].营养学报，2005，27（4）：322 ～ 325.

[16]周萍芳.苜蓿黄酮提取物对麻鸡生产性能及脂肪沉积的影响：[硕士学位论文][D].南昌：江西农业大学，2011.

[17]郑裕国，王远山，薛亚平，等.抗氧化剂的生产及应用[M].北京：化学工业出版社，2004.

[18]张研，曹国杰，张燕，等.黄酮类化合物的提取以及检测方法的研究进展[J]食品研究与开发，2008，29（1）：154 ～ 158.

[19]张咏梅，晏石娟，曹致中，等.微波辅助提取苜蓿黄酮方法的研究[J].草地学报，2008，16（1）：77 ～ 80.

[20]朱宇旌，李新华，张勇，等.苜蓿黄酮抗氧化性研究[J].沈阳农业大学学报，2006，37（4）：615 ～ 618.

[21]朱宇旌，张勇，任慧玲，等.苜蓿异黄酮纯化工艺研究[J].食品工业科技，2008，2：182 ～ 185，246.

[22]Boue S M，Wiese T E，Nehls S，et al.Evaluation of the estrogenic effects ofl legume extracts containing phytoestrogens[J].J Agric Food Chem，2003，51（8）：2193~2199.

[23]Cai H，Hudson E A，Mann P，et a1.Growth-inhibitory and cell cyclearresting properties of the rice bran constituent tricin in human-derived breast cancer cells in vitro and in nude mice in vivo[J].Br J Cancer，2004，91（7）：1364～ 1371.

[24]Cai H，AI-Fayez M，Tunstall R G，et a1.The ricebran constituent tricin potently inhibits cyclooxygenase enzymes and interferes with intestinal carcinogenesis in ApcMin mice[J].Mol Cancer，2005，4（9）：1287 ～ 1292.

[25]Fotsis T，Pepper M S，Aktas E，et a1.Flavoniods dietary-derived inhibitors for cell proliferation and in vitro angiogenesis[J].Cancer Res，1997，57（14）：2916～ 2921.

[26]Noteboom W.Estrogenic effect of genistein and coumestrol diacetate[J].Endocrinology，1963，88：262.

[27]Stewart A J，Chapman W，Jenkins G I，et al.The effect of nitrogen and phosphorus deficiency on flavones accumulation in plant tissues[J].Plant Cell Environ，2001，24（11）：1189.

[28]Strissel T，Halbwixth H，Hoyer U，et al.Growth-promoting nitrogen nutrition effects flavonoid biosynthesis in young apple （Malus domestics Borkh.）leaves[J].Plant Biol（Stuttg），2005，7（6）：677 ～ 685.

[29]Uesugi T，Toda T，Tsugi K，Ishida H.Comparative study on reduction of bone loss and lipid metabolism abnormality in ovariectomized rats by soy isoflavones，daidzin，genistin，and glycitin[J].Biol Pharm Bull，2001，24：368~372.

[30]Wang I K，Lin-Shiau S Y，Lin J.KInduction of apoptosis by apigenin and related flavonoids through cytochrome crelease and activation of caspase-9 and caspase-3 in leukaemia HL-60 cells[J].Eur J Cancer，1999，35（10）：1517 ～ 1525.