HPLC 法测定烫狗脊配方颗粒中原儿茶酸和原儿茶醛

周燕园

(桂林医学院，广西桂林541004)

烫狗脊配方颗粒是狗脊饮片经砂烫、水提、浓缩、干燥、制粒等工序制成的单味中药配方颗粒剂［1］。狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz(L.)J.Sm.的干燥根茎，味苦、甘，性温，归肝、肾经，具有祛风湿、补肝肾、强腰膝的功效，用于治疗风湿痹痛，腰膝酸弱，下肢无力等症［2-3］。《中国药典》采用砂烫法对其进行炮制。砂烫使狗脊易于去毛和粉碎及有效成分的煎出，狗脊炮制后有效成分含有量增加，刺激性成分含有量降低，故狗脊炮制可起到减毒增效的双重作用［4］。原儿茶酸和原儿茶醛是狗脊的活性成分，现代药理研究证实［5-7］，原儿茶酸具有增加冠脉流量，抑制体外血小板聚集和抗菌活性，原儿茶醛具有扩张冠状动脉，降低心肌耗氧量，抑制血小板聚集，抗肿瘤，清除自由基和抗脂质过氧化、抗炎的作用。烫狗脊活血、镇痛、抗炎的药理作用与原儿茶酸和原儿茶醛的药理作用相吻合。根据《中国药典》2010年版一部附录中药质量标准的研究要求，本实验参考文献［8-13］，建立了同时测定原儿茶酸和原儿茶醛含有量的HPLC方法，为烫狗脊配方颗粒的质量控制提供科学实验依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Agilent 8453紫外-可见分光光度计(美国安捷伦公司);BP211D电子分析天平(德国赛多利斯);LG16-W型高速离心机(北京医用离心机厂);SB3200-T超声清洗仪(上海必能信超声有限公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂);SHZ-D循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)。烫狗脊配方颗粒(江阴天江药业有限公司，批号:0906059、0912104、1003085，规格:每包1 g，相当于10 g药材饮片)，原儿茶酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110809-200604);原儿茶醛对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110810-200205);甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher公司)，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液(10∶90);体积流量1.0 mL/min;检测波长258 nm;柱温35℃。在此条件下，样品中原儿茶酸、原儿茶醛与其它峰均能达到基线分离，阴性无干扰，见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备分别精密称取原儿茶酸和原儿茶醛对照品适量，用50%甲醇溶解分别制成0.282，0.095 2 mg/mL的溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备取烫狗脊配方颗粒1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，称定质量，超声60 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足质量，摇匀，滤过，取续滤液离心即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备按处方工艺制备缺烫狗脊的阴性样品，按2.2.2项下方法制备阴性对照溶液。

图1 混合对照品(A)、阴性对照样品(B)和烫狗脊配方颗粒样品(C)HPLC色谱图

2.3 专属性试验分别精密吸取原儿茶酸和原儿茶醛混合对照品溶液、阴性对照溶液和供试品溶液各10 μL，进样分析，结果阴性对照溶液在原儿茶酸和原儿茶醛对照品保留时间处，无色谱峰，实验表明其他成分不干扰原儿茶酸和原儿茶醛的测定。

2.4 供试品处理的正交试验

2.4.1 因素水平的确定预试验结果显示，影响烫狗脊配方颗粒的主要提取工艺条件为含甲醇量、溶剂用量和超声提取时间，因此，采用L9(34)正交设计法对这3个影响因素进行考察和优化，样品用量为1 g，因素水平表见表1。按正交表设计方案进行试验，以原儿茶酸和原儿茶醛的含有量为评价指标，试验结果见表2。

表1 提取工艺因素水平

2.4.2 最佳提取工艺的确定表2极差大小显示，各因素影响程度依次为:A＞C＞B，由极差分析应选择最佳工艺为A1C2B1。由表3可知，因素A有显著性差异，即含甲醇量对提取率有显著性影响。综合直观分析和方差分析结果，可得出最佳提取工艺条件，即50%甲醇10倍量，超声提取60 min。

2.4.3 验证试验按上述优化的最佳条件，烫狗脊配方颗粒(批号:0906059)制备3份供试品溶液，每份1 g，进样10 μL分析。结果样品中的原儿茶酸、原儿茶醛的平均质量分数分别为1.614 3 mg/g、0.684 8 mg/g，平均总质量分数为2.299 1 mg/g，表明烫狗脊配方颗粒提取工艺稳定可行。

表2 L9(34)正交试验设计及结果(n=3)

表3 方差分析

2.5 线性关系考察精密吸取原儿茶酸、原儿茶醛对照品溶液1、2、4、6、8 mL分别置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，制成不同质量浓度的两种对照品溶液，所得质量浓度标准液及原质量浓度标准溶液各取10 μL，进样分析。分别以进样质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算得回归方程:原儿茶酸为Y=41 365.833 5X+11.254 089，r=0.999 94;原儿茶醛为Y=16 390.286 7X－3.798 771 3，r=0.999 93。结果表明，原儿茶酸在0.028 2～0.282 mg/mL，原儿茶醛在0.009 52～0.095 2 mg/mL范围内，均与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验上述色谱条件下，取混合对照品溶液(原儿茶酸质量浓度:0.17 mg/mL，原儿茶醛质量浓度:0.078 mg/mL)，连续进样5次，每次10 μL，记录峰面积，计算精密度。原儿茶酸、原儿茶醛峰面积的RSD值分别为0.69%和0.58%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验精密称取同一批号供试品(批号:0906059)，按定量测定方法操作，进行6次平行实验，结果原儿茶酸的平均质量分数为1.617 8 mg/g，RSD为1.26%;原儿茶醛的平均质量分数为0.694 5 mg/g，RSD为1.58%，表明含有量测定方法重复性良好。

2.8 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液(批号:0906059)10 μL，分别于0、2、6、12、18、24 h进样，记录所测组分峰面积，计算原儿茶酸、原儿茶醛色谱峰面积的RSD分别为1.19%、1.83%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 加样回收试验精密称取已知含有量的烫狗脊配方颗粒样品(批号:0906059)约0.5 g，6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液(原儿茶酸质量浓度为0.164 mg/mL，原儿茶醛质量浓度为0.07 mg/mL)5mL，按供试品溶液方法制备，进样10 μL，测定峰面积，计算含有量，结果原儿茶酸和原儿茶醛的平均回收率(n=6)98.45%(RSD为1.33%)及98.76%(RSD为1.51%)。结果见表4。

表4 加样回收率测定结果(n=6)

2.10 样品测定分别精密称取3批号的烫狗脊配方颗粒，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，进样10 μL，记录原儿茶酸和原儿茶醛的峰面积，由线性方程计算各自质量分数，测定结果见表5。

表5 样品中原儿茶酸和原儿茶醛测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 本研究考察了甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液流动相系统，以及不同磷酸的量对分离效果的影响，最后结合文献报道［8-13］和实验结果选择了甲醇-0.1%磷酸溶液(10∶90)作为流动相，流动相中含有0.1%的磷酸可以使原儿茶酸和原儿茶醛得到了良好的分离，各组分色谱峰的峰形和分离度均达到要求。

3.2 经紫外扫描，原儿茶酸在258 nm处有最大吸收峰，原儿茶醛在280 nm处有最大吸收峰，因供试品溶液在280 nm处干扰峰相对较多，原儿茶酸和原儿茶醛在258 nm处都有较好的吸收，且干扰峰较少，峰形良好，故本试验采用258 nm的检测波长对原儿茶酸和原儿茶醛的含有量进行准确检测。

3.3 本实验考察了含甲醇量、溶剂用量和超声提取时间3个因素对烫狗脊配方颗粒中原儿茶酸与原儿茶醛提取率的影响，并进行了正交试验。结果表明，在10倍量50%甲醇，超声提取60 min的条件下，原儿茶酸与原儿茶醛的提取率最高。

3.4 《中国药典》2010年版一部狗脊项下规定了原儿茶酸的检测标准，本实验结果表明，原儿茶酸与原儿茶醛成分的含有量可同时作为狗脊不同配方颗粒的质量评价指标，其含有量标准尚需结合多厂家、多批次的配方颗粒含有量测定结果而定。

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