肠康颗粒对溃疡性结肠炎大鼠NO水平及NOS活力的影响

刘青梅 韩 辅 (长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021)

溃疡性结肠炎(UC)的发病目前认为主要与遗传、免疫、环境等因素的相互作用有关。细胞因子在UC发病中发挥重要作用。目前认为减少一氧化氮(NO)产生，抑制诱导型NO合成酶(iNOS)表达可能是治疗UC的有效靶点之一。本实验主要观察中药肠康颗粒对UC大鼠NO水平及NOS活力的影响，从而进一步验证该药疗效，探讨其治疗UC的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 采用Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重(200±20)g，由吉林大学医学实验动物中心提供。

1.1.2 实验药品 肠康颗粒由干姜、白术、桂枝、茯苓、肉豆蔻、乌梅、五味子等组成，由长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心药物制剂研究室加工;柳氮磺吡啶(上海信谊嘉华药业有限公司生产，批号H31020557);5%三硝基苯磺酸(TNBS)水溶液购自Sigma公司;乙醇为国产分析纯。

1.1.3 主要试剂 NO试剂盒、NOS试剂盒(南京建成生物工程研究所生产);双蒸水(吉林大学基础医学院自制)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 60只大鼠适应性喂养7 d后，随机分为乙醇对照组、模型组、肠康颗粒低、中、高剂量组，柳氮磺吡啶(SASP)组，每组10只。乙醇对照组以50%乙醇0.25 ml灌肠;其余5组以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 ml混合试剂灌肠。

1.2.2 模型制备 所有动物禁食48 h后，乙醚麻醉，取12 cm聚丙烯管(直径2 mm)，剪侧孔数处，并由肛门插入结肠8 cm达结肠部位，快速注入药液后，捏紧肛门，提取大鼠尾巴保持倒立1 min，以防注入液倒流，待麻醉清醒后正常喂养。

1.2.3 给药方法 肠康颗粒低、中、高剂量组分别按生药11、22、44 g/kg剂量，用无菌蒸馏水调制成溶液灌胃(正常人用量换算成大鼠剂量的5、10及20倍);SASP组按0.5 g/kg剂量，用无菌蒸馏水调制成溶液灌胃，灌胃体积均为10 ml/kg;乙醇对照组及模型组灌服等体积生理盐水。各组于造模后第3天开始灌胃，每日一次，连续21 d。

1.2.4 标本取材 连续灌胃21 d后，麻醉各组大鼠，腹主动脉无菌取血，经 3 500 r/min，15 min低温离心，分离血清，－20℃保存，按试剂盒说明书检测血清NOS水平。取肛门至盲肠部结肠(约8 cm)，沿肠系膜纵轴剪开，取肠组织一部分，除去血液，滤纸吸干，称重，在预冷的pH7.4的匀浆介质中制成10%匀浆，4 000 r/min离心15 min，取上清液，置－20℃保存，以备检测NO含量。

1.2.5 检测指标

1.2.5.1 结肠黏膜NO水平测定 运用硝酸还原酶法检测NO含量。试剂盒说明书操作。计算公式:NO含量(μmol/gprot)=(测定管吸光度－空白管吸光度)/(标准管吸光度－空白管吸光度)×标准品浓度 ×样本的蛋白含量(mgprot/ml)。

1.2.5.2 血清NOS活力测定 运用硝酸还原酶法检测血清NOS活力，严格按说明书操作。总NOS活力(U/ml)=(总NOS测定管OD值－空白管OD值)/呈色物纳摩尔消光系数×(反应液总体积/取样量)×1/(比色光径×反应时间)÷1 000

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，数据资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 NO含量变化 与乙醇对照组 NO含量〔(1.67±0.07)μmol/gprot〕相比，其他各组大鼠结肠组织NO含量明显增高(P＜0.01)。与模型组〔(4.33±0.49)μmol/gprot〕相比，肠康颗粒低、中、高剂量组〔(2.78±0.29)、(2.52±0.12)、(2.11 ± 0.21)μmol/gprot〕 及 SASP 组 〔(2.43±0.13)μmol/gprot〕NO含量明显降低(P＜0.01)。高剂量组的NO含量较低剂量组明显下降(P＜0.01)。

2.2 血清中NOS活性 模型组〔(49.39±6.54)U/ml〕、肠康颗粒 低 〔(35.89 ±3.16)U/ml〕、中 剂 量 组 〔(30.78 ±2.96)U/ml〕及 SASP 对照组〔(26.37 ±3.50)U/ml〕与乙醇对照组〔(17.68±3.03)U/ml〕相比，NOS活性明显增强(P＜0.01)。高剂量组〔(21.15±3.60)U/ml〕与乙醇对照组相比，NOS活性也增强(P＜0.05)。与模型组对比，其他各治疗组的NOS活性明显降低，具有显著性差异(P＜0.01)。与低剂量组比较，高剂量组及SASP对照组的NOS活性明显降低(P＜0.01);中剂量组与低剂量组相比，NOS活性也明显降低(P＜0.05)。

3 讨论

NO是一种免疫分子和炎症介质，也是一种自由基。NO在UC炎症过程中充当了双重角色，既有保护作用，又有杀伤毒性和促炎作用。在炎症初期，可抑制激活的巨噬细胞和T细胞的功能，并能抑制血小板聚集，防止血栓形成;同时抑制髓过氧化物酶的活性，保护上皮屏障及促进上皮修复。随着炎症的持续和发展，大量的NO释放到组织，此时NO主要发挥组织损伤作用。NO由NOS催化L-Arg产生，UC病变黏膜中，NOS活性增高及NO浓度的增加与炎症程度呈平行关系。体内NOS分结构型(cNOS)和诱导型(iNOS)两大类，在UC结肠黏膜层主要以iNOS为主。cNOS是钙离子和钙调蛋白依赖性酶，存在于机体部分神经元，血管内皮细胞中具有稳定的活性，持续释放少量NO作为神经递质，起局部血流调节作用，对肠黏膜具有保护作用。iNOS是一种诱生酶，静息状态下不表达，当细胞接受各种刺激，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)，可使其表达大量增加〔1，2〕，合成大量 NO。iNOS 持续时间很长，催化的NO对肠黏膜有杀伤毒性及促炎作用。NO具有趋化中性粒细胞和单核细胞作用，并可与超氧阴离子反应生成具有高度细胞毒性的过氧亚硝酸盐，破坏细胞的功能和结构;过量的NO还可使血管扩张，通透性增加，导致黏膜充血、水肿，有助于炎症的始动与发展〔3，4〕。研究表明〔5，6〕，在 UC 患者活动期肠黏膜组织及血清中NO含量均有增加，且活动期UC患者病变黏膜炎症严重程度与iNOS和NO浓度有关;在重度UC病变黏膜，iNOS和NO的浓度比轻度UC者明显增高。过量的NO可能影响肠道免疫功能并产生细胞毒作用，如可导致细胞膜脂质过氧化、蛋白质巯基氧化、亚硝基化及DNA链断裂等。Middleton等〔7〕发现活动期UC患者肠灌液亚硝酸盐浓度异常增多，结肠iNOS活性明显增强，NOS抑制剂可明显改善结肠损伤的范围和程度。因此，抑制iNOS表达减少NO产生可能是治疗UC的有效靶点之一。李军华等〔8〕采用免疫组织化学染色检测肠组织iNOS表达，生化方法检测NO含量，结果显示，与正常组及生理盐水组相比，UC大鼠肠组织中iNOS表达及NO含量显著增高(P＜0.01)，且在病情严重组增高尤为明显，认为iNOS可能参与了UC发生、发展。刘少平等〔9〕采用免疫组化方法检测结肠组织NO、过氧化物酶(MPO)、前列腺素E2(PGE2)含量及cNOS、iNOS的表达水平，结果阿魏酸钠(200、400、800 mg/kg)灌肠用药均降低模型组大鼠升高的结肠黏膜损伤指数(CMDI)及结肠组织NO、MPO、PGE2含量，下调iNOS过度表达，亦抑制cNOS正常表达，呈现一定量效关系。

本研究中UC大鼠结肠组织NOS活性及NO含量显著升高，表明增多的NO主要来源于NOS。肠康颗粒给药后，NOS、NO均下降，提示肠康颗粒可能主要通过抑制NOS表达减少NO生成，从而减轻NO引起的损伤。本研究结果亦表明肠康颗粒对NOS、NO的降低程度与用药呈现一定量效关系。

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8 李军华，何小飞，于皆平，等.NF-κB、iNOS在大鼠实验性结肠炎肠组织的表达及意义〔J〕.胃肠病学和肝病学杂志，2003;12(5):436-9.

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