大蒜汁抑菌作用的研究

雷晓燕

(沈阳化工大学环境与生物工程学院，辽宁沈阳110142)

大蒜(Allium sativum L.)别名胡蒜，多年生宿根草本植物，可食部分为地下鳞茎，味辛辣［1］.早在4 000多年前人们就已开始食用大蒜，大蒜不仅是调味品，也是具有天然疗效的保健食品，它的药用价值早在李时珍的《本草纲目》中就有详细记载.近年来，大蒜因其含有多种营养成分和独特保健功能备受世人瞩目［2］.大蒜不仅富含蛋白质、糖类、多种维生素及矿物质等营养成分，而且含有有明显功能作用的大蒜素.大蒜素是大蒜中大蒜辣素、大蒜新素以及多种烯丙醛硫醚等化合物的总称［3］.大蒜素有促进新陈代谢、降低胆固醇的作用，对高血压、高血脂、动脉硬化和糖尿病等疾病有一定的疗效［4－6］.据报道大蒜中的活性成分可以进入致病菌的细胞质，干扰细胞的正常代谢，从而有对致病菌的抑制和杀灭作用，所以大蒜被人们誉为是天然广谱抗生素［7－8］.大蒜以无过敏反应、无副作用、无毒性等得天独厚的优点，一直被世界各国人民广泛使用，目前大蒜在医疗、农业、食品等领域已受到了高度的重视，各种相关的系列产品正在不断地开发中［9－10］.我国是世界上大蒜产量最高的国家，充足的原料来源使我们有优越的条件对大蒜及其系列产品进行深度开发.本实验旨在为大蒜在人们日常生活中的应用以及在食品工业中的开发利用提供理论依据.

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)，由沈阳化工大学微生物实验室提供.

1.1.2 大蒜

新鲜，无芽，无虫蛀的白皮马芽蒜，购自沈阳市铁西区九路农贸市场.

1.1.3 培养基

(1)细菌液体培养基:蛋白胨质量分数1.0%，NaCl质量分数0.5%，牛肉膏质量分数0.3%，pH值7.2～7.4.

(2)细菌固体培养基:蛋白胨质量分数1.0%，NaCl质量分数0.5%，牛肉膏质量分数0.3%，琼脂质量分数2.0%，pH值7.2～7.4.

1.1.4 主要试剂

培养基成分为市售分析纯和生化试剂.

1.1.5 主要仪器

DHP-420电热恒温培养箱，光明医疗仪器厂;LDZX-40BⅠ型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂;ZD-85气浴恒温振荡器，常州国华电器有限公司;WD900微波炉，顺德市格蓝仕电器实业有限公司;HNP-1水平流形超净工作台，南通沪南科学仪器有限公司;101-2A型数显式电热恒温干燥箱，上海阳光实验仪器有限公司;FA1104分析天平，上海精科天平有限公司;BC/BD-428A卧式冷藏冷冻转换柜，青岛海尔特种电冰柜有限公司;722-2000型分光光度计，山东高密彩虹分析仪器有限公司;HH4型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 大蒜汁的制备

取新鲜大蒜，去皮，洗净并晾干表面水分，在无菌的试验条件下，用刀片将蒜切成小块，在研钵中将大蒜研碎至蒜泥状.将制得的蒜泥用两层无菌纱布挤压过滤得到大蒜汁原汁，备用.

1.2.2 试验菌菌悬液的制备

将试验菌接种于斜面培养基上，37℃培养18 h，用接种环取适量菌体，接种于20 mL液体培养基，37℃水浴震荡培养18 h.18 h的菌悬液用血球计数板进行计数，若计数结果显示菌悬液数量超过1×109～2×109个/mL，将菌悬液进行梯度稀释使菌数量达到1×109～2×109个/mL，备用.

1.2.3 大蒜汁对试验菌抑菌圈的测定

取含菌量为1×109～2×109个/mL的试验菌1 mL，加入无菌平皿中.将固体培养基加热至完全溶化，待晾至适宜温度，倒入平皿中制成混菌平板.用无菌镊子在混菌平板表面放两张直径2 cm的无菌滤纸片，用微量注射器吸取50 μL大蒜汁滴加在滤纸片上，然后将平皿置于37℃恒温培养箱中培养.24 h后观察滤纸片周围是否有不长菌的透明抑菌圈，若有抑菌圈测定抑菌圈直径.

1.2.4 大蒜汁对3种试验菌最低抑菌浓度的测定

取适量大蒜汁原液，加入等量无菌蒸馏水中，得到体积分数为50%的大蒜汁稀释液，再依次将大蒜汁稀释为体积分数为25%、12.5%、6.25%的大蒜汁稀释液.分别用含菌量为1× 109～2×109个/mL的3种试验菌菌悬液制成混菌平板，待凝后在混菌平板上放置无菌滤纸片，在滤纸片上分别滴加50 μL体积分数为50%、25%、12.5%和6.25%的大蒜汁，将平皿置于37℃恒温培养箱中培养.24 h后观察并测定抑菌圈直径.

1.2.5 温度对大蒜汁抑菌作用的影响

将体积分数为25%的大蒜汁分别装在5个无菌空瓶中，分别在15℃、35℃、55℃、75℃、95℃恒温水浴锅中处理1 h后备用.分别取含菌量为1×109～2×109个/mL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各1 mL制成混菌平板.分别测定不同温度下处理过的体积分数为25%的大蒜汁对3种试验菌的抑菌作用.

1.2.6 pH值对大蒜汁抑菌作用的影响

将体积分数为25%的大蒜汁的pH值分别调为3.0、4.0、5.0、6.0和7.0.分别取含菌量为1×109～2×109个/mL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各1 mL制成混菌平板.分别测定不同pH值的体积分数为25%的大蒜汁的抑菌作用.

1.2.7 热处理时间对大蒜汁抑菌作用的影响

将体积分数为25%的大蒜汁分别装在6个无菌空瓶中，分别在55℃恒温水浴锅中处理0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h后，取出备用.分别取含菌量为1×109～2×109个/mL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各1 mL制成混菌平板.分别测定不同热处理时间的体积分数为25%的大蒜汁的抑菌作用.

1.2.8 大蒜汁对试验菌株生长抑制作用的测定

将试验菌接种于斜面培养基活化后，用接种环取适量菌体，接种于20 mL液体培养基，37℃水浴震荡培养18 h.以5%的接种量将培养液接入50 mL新鲜液体培养基中，同时接种多个摇瓶，其中一半摇瓶中各接入2 mL的体积分数为25%的大蒜汁，另外一半摇瓶不加大蒜汁，37℃进行培养.分别培养0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、8.0 h、12.0 h，在560 nm处测定培养液的OD值.

2 结果与讨论

2.1 大蒜汁对3种试验菌最低抑菌浓度的测定

试验结果如图1～图3所示.从试验结果可知:大蒜液的浓度越高，杀菌效果越好，对于金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，体积分数为25%的大蒜汁仍有抑菌作用，12.5%的大蒜汁几乎没有抑菌作用，可见大蒜汁对这两种细菌的最低抑菌体积分数均为25%.而12.5%大蒜汁对大肠杆菌仍有抑制作用，抑菌圈直径达到2.1 cm，所以，大蒜对大肠杆菌的最低抑菌体积分数为12.5%.可知大蒜汁对大肠杆菌的抑制作用强于金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌.

图1 大蒜汁对金黄色葡萄球菌的最低抑菌体积分数Fig.1 The minimum inhibitory concentration of garlic juice against S.aureus

图2 大蒜汁对大肠杆菌的最低抑菌体积分数Fig.2 The minimum inhibitory concentration of garlic juice against E.coli

图3 大蒜汁对枯草杆菌的最低抑菌体积分数Fig.3 The minimum inhibitory concentration of garlic juice against B.subtilis

2.2 温度对大蒜汁抑菌作用的影响

体积分数为25%大蒜汁分别在15℃、35℃、55℃、75℃和95℃的温度下保温处理1 h，其结果如表1所示.由表1可见:经过不同温度热处理后的大蒜汁状态发生了改变，在35℃时处理1 h后的大蒜汁抑菌作用已低于常温状态下的大蒜汁，且随着温度的升高，大蒜汁的抑菌效果逐渐下降，在温度＞55℃时，大蒜汁的抑菌作用明显减弱.当大蒜汁热处理超过75℃时，只对大肠杆菌抑制作用.

表1 温度对大蒜汁抑菌作用的影响Table 1 The effection of inhibition of garlic juice by temperature

2.3 pH值对大蒜汁抑菌作用的影响

将体积分数为25%的大蒜汁的pH值分别调节至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，由表2可见:蒜汁在较宽pH值范围内均可产生抑菌效果，但在pH=5.0～6.0之间时抑菌效果较明显，表明大蒜汁在弱酸性条件下抑菌活性较好.

表2 pH值对大蒜汁抑菌作用的影响Table 2 The effection of inhibition of garlic juice by pH

2.4 热处理时间对大蒜汁抑菌作用的影响

在55℃下分别将大蒜汁处理不同的时间，热处理时间对大蒜汁抑菌作用的影响见表3.由表3可见:处理0.5 h大蒜汁的抑菌效果最佳，处理1 h抑菌活性基本保持不变，在1.5 h时，抑菌作用开始减小，之后随着时间的延长，抑菌作用逐渐减小直至消失，在处理3 h后对试验菌株基本没有了抑制作用.由此可知大蒜素在55℃下加热会逐步失去活性.

表3 热处理时间对大蒜汁抑菌作用的影响Table 3 The effection of inhibition of garlic juice by heat treatment time

2.5 大蒜汁对试验菌株生长曲线抑制作用的测定

由图4、5和6可知加入大蒜汁的菌悬液在开始时的吸光度略高于未加蒜汁的菌悬液.这是因为大蒜汁并未经过离心，较混浊，所以，在较短的作用时间里由于蒜汁本身的浊度对OD值产生了影响.但在这之后，可明显地观察到加入大蒜汁的菌悬液OD值升高很缓慢，其菌体的生长速率明显受到抑制.未加蒜汁的菌体生长过程随时间的变化经历了延滞期、对数生长期、稳定期及死亡期等4个时期，而加入大蒜汁的菌体生长趋势明显受到了抑制，没有对数生长期，即没有菌浓度迅速增加的过程，说明大蒜汁可明显抑制试验菌的生长，减少菌体数量.

图4 大蒜汁对金黄色葡萄球菌生长曲线的抑制作用Fig.4 The inhibition of garlic juice against growth curve of S.aureus

图5 大蒜汁对大肠杆菌生长曲线的抑制作用Fig.5 The inhibition of garlic juice against growth curve of E.coli

图6 大蒜汁对枯草杆菌生长曲线的抑制作用Fig.6 The inhibition of garlic juice against growth curve of B.subtilis

3 结论

(1)大蒜汁的抑菌作用会受到试验菌株种类、大蒜汁体积分数、温度、加热时间、pH等因素的影响.

(2)大蒜汁对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的最低抑菌体积分数分别为12.5%、25%和25%.

(3)大蒜汁随着温度的升高其抑菌作用逐渐减弱，当温度达到75℃时，大蒜汁只对大肠杆菌还有较弱的抑菌作用，在55℃下随着热处理时间的延长抑菌作用逐渐减弱，处理3 h后完全丧失抑菌作用.

(4)大蒜汁在弱酸性条件下对试验菌株的抑菌作用较强，随着酸性的增强抑菌作用逐渐减弱，在碱性下没有抑菌作用.

(5)通过大蒜汁对3种试验菌株生长曲线影响的测定可知大蒜汁可明显抑制菌体的生长，减少菌体的数量.

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