一株珙桐内生细菌GT21的鉴定及系统发育分析

马莉莉，张宇美，宋培勇

（1.湄潭县求是高级中学，贵州湄潭564106；2.广东海洋大学生命科学学院，广东湛江5240883；3.遵义师范学院生物系，贵州遵义563002）

植物内生菌指生活在植物体内而一般不引起植物病害的微生物的总称，包括真菌、细菌和放线菌，是一类潜在的宝贵的微生物资源，具有增强宿主植物抗逆性、抗病虫害和促进植物生长等作用以及用于转基因操作等。内生菌促进植物生长的机制是通过生物固氮、产生植物激素、增强矿质营养吸收、抑制植物病原体等来实现的。Ryu等还发现了内生细菌一种新的促生长机制：产生挥发性物质如2，3-丁二醇和Aceotin来促进植物生长[1]。Downing等和Turner等报道了转基因工程内生细菌Herbaspirillum serope dicae和Clavibacter xylii能产生并分泌原本为苏云金芽孢杆菌产生的对多种昆虫幼虫有毒杀作用的δ-内毒素[2，3]。迄今虽然已有很多植物内生菌的报道，但是有关珙桐内生菌的报道较少，何映霞等报道了从珙桐中分离到一株产黄酮内生真菌Asper-gillus fumigatus[4]，宋培勇等对从珙桐中分离到的15株内生细菌进行了分子鉴定和系统发育分析[5]。对珙桐等珍稀植物进行内生菌分离鉴定并加以深入研究，不但可以了解其内生菌生物多样性、群落结构、生物学特征及其与宿主植物相互关系等，而且从中还可能筛选出具有实际应用价值的生防菌株或产生生物活性物质的菌株，为珙桐等珍稀野生植物资源的保护和开发提供科学依据。本文以从珙桐中分离到的一株内生细菌为出发菌株，对其进行了较为系统的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

试验所用菌株GT21，由遵义师范学院生物系微生物实验室提供，从采自贵州宽阔水国家级自然保护区的珙桐叶柄中分离而得。

1.1.2 主要试剂和仪器

试验中所用的PCR扩增引物为：27f:5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1525r:5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′（生工）。2×Taq PCR MasterMix（天根），胶回收试剂盒（Omega），PCR扩增仪（BioRad），WD-9413A凝胶成像系统（北京六一）。

1.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基、脲酶测定培养基和卵磷脂酶测定培养基以及V-P反应、甲基红试验，吲哚试验和糖发酵试验等培养基参考文献[6]进行配制。

1.2 方法

1.2.1 内生细菌GT21转接

利用无菌操作技术从斜面挑取少量菌苔划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，25℃培养直至长出单菌落。

1.2.2 内生细菌的形态学鉴定

菌落形态：观察菌落的大小、颜色、质地、边缘、凸起、干湿、光泽等特征。

细胞形态：参考文献[6]介绍的方法对供试菌株进行革兰氏染色观察，用孔雀绿染色观察芽孢。1.2.3生理生化鉴定

接触酶、脲酶、卵磷脂酶测定，V-P反应，甲基红试验，吲哚试验，糖发酵试验以及耐盐性试验等按文献[6]进行。

1.2.4 16S rDNA PCR扩增及测序

基因组DNA提取按文献[7]介绍的水煮法进行。16S rDNA PCR扩增体系和条件见文献[5]。

凝胶电泳检测16S rDNA PCR扩增结果，用凝胶回收试剂盒切胶纯化后，交北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。

1.2.5 同源性比对及系统发育树的构建

登录NCBI用BLAST软件将测序结果与Gen－Bank中的已知序列进行比对，查找相似性最高的菌种，取相似性最高的5株同源菌株和1株苏云金芽孢杆菌与GT21的16S rDNA序列，用MEGA4.0软件进行多序列比对，构建出系统发育树。

2 结果与讨论

2.1 形态鉴定

菌株GT21在牛肉膏蛋白胨培养基上形成的菌落较薄，椭圆形或近圆形，乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明。革兰氏染色呈阳性，细胞呈杆状。芽胞为椭圆形或柱状，端生或次端生。

2.2 生理生化鉴定

对菌株GT21进行了13项生理生化测试，结果列于表1。

表1 菌株GT21生理生化反应结果

2.3 耐盐性试验

耐盐性试验表明，待测菌株能在质量分数为11%，13%的培养基中生长，不能在质量分数为7%和9%的培养基中生长。

根据形态学和生理生化特征，并与文献[8]记录的芽孢杆菌属（Bacillus）的所有种进行一一比较，发现该菌株与该菌属的所有种不一致。

2.416 S rDNA的PCR扩增与测序

GT21菌株16S rDNA PCR扩增产物大小为1500bp左右，实际测序结果为1293个核苷酸（Nt）（见图1），其中左图为16S rDNA PCR扩增结果：M为200bp DNA Ladder，21指珙桐内生菌株GT21；右图为16S rDNA测序结果。

输入测序结果（查询号NS9GUZHR013），利用BLAST进行搜索比对，查找相似性最高的同源菌株，发现与其相似性最高的同源菌株为Bacillus sp.SAP02_1（注册号：JN872500），相似性97%。取相似性最高的前5株同源菌株：Bacillus sp.SAP02_1（注册号JN872500），Bacillus sp.MB1（2011）（注册号HQ600985）、Bacillus sp.LM6（注册号JN208185）、Bacillus sp.BM3（2011）（注册号JF825991）、Bacillus sp.PKSWII（注册号F768713）以及苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）（注册号FN433029）和GT21共7株细菌的16S rDNA序列，利用Mega4.0软件构建出系统发育树（见图2），GT21单独一支，其余6株细菌聚为一支，GT21与Bacillus sp.PKSWII和Bacillus sp.LM6亲缘关系较近，而与Bacillus sp.SAP021、Bacillus sp.BM1（2011）等亲缘关系较远。

图1 GT2116S rDNA的PCR扩增与测序结果

图2 GT21及其同源菌株基于16S rDNA序列的系统发育树

3 结论与展望

对从珙桐中分离得到的内生细菌GT21进行形态学、生理生化特征等系统研究，并结合分子鉴定结果，根据文献[8]将其初步鉴定为芽孢杆菌（Bacillus），与文献中记录的种不一致，是否为一新种，有待进一步鉴定。根据16S rDNA测序结果用BLAST软件进行相似性搜索比对，发现其相似性最高的菌株为Bacillus sp.SAP02_1，相似性为97%。通过构建系统进化树发现GT21与Bacillus sp.PKSWII和Bacillus sp.LM6亲缘关系更近，而与Bacillus sp.SAP02_1等亲缘关系较远。

芽孢杆菌的分布和应用较广，如在农业上，苏云金芽孢杆菌是生防菌的典型代表。在酿造工业上，罗俊成从浓香型白酒糟醅中分离并鉴定了地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）以及蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）[9]。在医药工业上，地衣芽孢杆菌是人用微生物制剂“整肠生”的主要成分。在饲料工业上，芽孢杆菌也是饲用微生物制剂“益生素”、“EM”等的主要成分之一[10]。在教学和科研上，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等是常用的菌株。

植物内生菌的分离可能因取样、表面消毒及培养基的不同，其数量和种类往往存在较大差异，仅仅依靠传统的分离培养方法，想无偏好的分离到植物体内大多数的内生菌（更不用说所有的内生菌）是不现实的。令人兴奋的是关于植物内生菌的研究方法目前已取得重大进展，中科院昆明植物研究所曾英研究组利用宏基因组学方法研究了滑桃树（Trewia（nudiflora）内生菌，在世界上首次建立了植物内生菌宏基因组文库[11]。随着宏基因组学的发展和相关技术的成熟和完善，宏基因组学用于植物内生菌研究将更加广泛。

[1] Ryu CM，FaragM A，Hu CH，etal.Bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis[J].PNAS，2003，100（8）:4927-4932.

[2] Downing K J，Leslie G，Thomson J A.Biocontrol of the sugarcane borer Eldana saccharina by expression of the Bacillus thuringiensis cry1Ac7 and Serratia marcescens chiA genes in sugarcane-associated bacteria[J].Appl Environ Microbiol，2000，66（7）:2804-2810.

[3] Turner J T，Lampel J S，Stearman R S，et al.Stability of the δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis subsp.kurstakiin a recombinant strain of Clavibacterxyli subsp.Cynodontis[J].Appl Environ Microbiol，1991，57（12）:3522-3528.

[4] 何映霞，冉雪琴，王嘉福.珙桐产黄酮内生真菌的分离和鉴定[J].贵州农业科学，2008，36（3）:3-6.

[5] 宋培勇，李凤华，马莉莉.珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析[J].微生物学通报，2011，38（1）:8-13.

[6] 周德庆.微生物学实验手册[M].上海:上海科学技术出版社，1983.

[7] 陶天申，杨瑞馥，东秀珠.原核生物系统学[M].北京:化学工业出版社，2007.

[8] R E布坎南，N E吉本斯.伯杰细菌鉴定手册（第8版）[M].北京：科学出版社，1984.29-758.

[9] 罗俊成.浓香型白酒糟醅中芽孢杆菌属细菌的分类鉴定和16S rDNA序列系统发育分析[D].成都：四川大学，2007.

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