HPLC法测定杨梅叶中杨梅苷的含量

齐 洁，万竹青，李默影，吴秋月，刘丽芳

(中国药科大学天然药物活性物质与功能国家重点实验室，江苏南京210009)

杨梅叶为杨梅科杨梅属植物杨梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc.)的干燥叶，杨梅广泛分布于我国长江以南的浙江、江苏、福建、广东、广西、江西、湖南等省。其果实是深受人们喜欢的水果之一。根据《中华本草》记载，杨梅叶味苦、微辛，性温，功能为燥湿袪风，止痒，主治皮肤湿疹，外用适量，煎水洗便可［1］。杨梅苷是杨梅叶中的有效成分之一，具有明显的DPPH自由基清除能力［2］，对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠有降血糖作用［3］，且具有明显的降压［4］、抑菌［5］等多种药理活性，在食品抗氧化方面也具有很强的优越性。因此，本文采用HPLC法对杨梅叶中的杨梅苷含量进行测定，该方法快速，简单，准确，为杨梅苷的进一步开发利用提供科学的依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪;分析天平(Sartorius);KH－250DB超声清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司);RE－5203旋转蒸发器(上海亚容生化仪器厂);乙腈(色谱纯，Merck公司);纯净水(娃哈哈纯净水);乙醇、磷酸(分析纯)。

杨梅苷对照品(购于上海同田生化技术有限公司，纯度大于98%);杨梅叶(采自江西)，经中国药科大学刘丽芳教授鉴定为杨梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc.)的干燥叶。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Diamonsil C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm)柱;流动相:乙腈(A)－0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脱程序(见表1);流速:1.0 mL/min;检测波长:358 nm;柱温:30℃;进样量:20 μL。在该色谱条件下，杨梅苷理论塔板数为9750，杨梅苷与各峰的分离度R均大于1.5(见图1、2)。

表1 梯度洗脱程序

图1 杨梅苷对照品色谱图

图2 样品色谱图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取杨梅苷对照品4.40 mg，置于5 mL量瓶中，以20%乙腈超声溶解，定容，摇匀，配置成0.880 mg/mL，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取杨梅叶粗粉2.5 g，精密称定，以50 mL 50%乙醇水浴回流提取1 h，过滤后，滤渣再同法提取2次，合并提取液。将提取液减压回收乙醇后，用20%乙腈溶解定容至100 mL量瓶中，摇匀后，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 标准曲线

精密吸取上述杨梅苷对照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置于 1 mL 量瓶中，加20%乙腈稀释至刻度，摇匀，分别配成 0.088，0.176，0.352，0.528，0.704，0.880 mg/mL 的系列对照品溶液;分别精密吸取上述不同浓度对照品溶液20 μL注入色谱仪，按照上述色谱条件测定，以峰面积(A)为纵坐标，杨梅苷浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，计算得过原点的回归方程为A=36113C－401.56，r=0.9994，表明杨梅苷浓度在 0.088 ～0.880 mg/mL内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液20 μL，在上述色谱条件下，重复进样6次，测定杨梅苷峰面积，RSD=0.5%，表明精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批杨梅叶样品，平行称定6份，按照供试品溶液制备方法制备，每份精密吸取20 μL，测定峰面积并计算杨梅苷的含量，RSD=2.8%，表明该方法重复性较好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液分别在 0，1，3，6，12，24 h 测定，进样20 μL，测定杨梅苷峰面积，RSD=1.9%，表明样品在24 h内稳定。

2.8 回收率试验

取已测定杨梅苷含量的杨梅叶适量，精密称定9份，每3份为一组，分别加入样品中所含杨梅苷量的80%，100%，120%对照品，按照供试品溶液的制备方法制备后，取续滤液20 μL进行测定，所得平均回收率为102.4%，RSD=1.6%。结果见表2。

2.9 样品测定

按照上述条件测定样品，外标法计算得杨梅叶中杨梅苷的平均含量为1.43%(n=3)。

表2 回收率试验结果(n=9)

3 讨论

实验中曾对提取条件进行了优化，通过正交试验法考察了乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数对杨梅苷含量的影响，并经验证得到最优提取条件为20倍50%乙醇提取1h，提取3次。

杨梅苷具有多种药理作用，在临床上具有广泛的应用价值。杨梅叶在我国长江以南地区分布广泛，为可再生资源，且其中杨梅苷含量高，本次实验为杨梅叶的合理开发利用奠定了一定的理论基础。

［1］中华本草编委会.中华本草［M］.上海:上海科学技术出版社，1999:367－369.

［2］赵 丽，徐淑萍，张 蕾，等.杨梅素及类似物乙酰胆碱酯酶抑制和抗氧化活性研究［C］//2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集，2010.

［3］张 立.杨梅苷对四氧嘧啶模型小鼠降血糖作用的初步研究［J］.中国现代药物应用，2009，3(15):29－30.

［4］张秀桥，沈 伟，陈树和，等.大叶蛇葡萄提取物对肾性高血压大鼠降压作用的实验研究［J］.中国医院药学杂志，2008，28(24):2095.

［5］张绍勇，李 桥，陈安良.杨梅叶抑菌活性成分初步分离与鉴定［J］.农药学学报，2011，13(2):149－154.