核仁磷酸蛋白基因突变检测及其临床意义

马 亮，殷奖悠，湛玉良

（中日友好医院 检验科，北京 100029）

随着基因组学的发展，对白血病分子遗传学及分子生物学的研究不断深入，发现急性髓细胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML）中存在多种不同的基因突变和基因表达的改变，目前对核仁磷酸蛋白基因1（nucleophosmin family，member 1，NPM1）研究较多，该基因突变与患者的临床表现和预后有很大的相关性，现作一综述。

1 NPM的结构和生物学功能

核磷素（nucleophosmin，NPM），也称为核仁磷酸蛋白B23或核仁间质蛋白，包括NPM1、NPM2及NPM3 3种亚型。NPM1是位于核仁颗粒区的主要蛋白分子之一，能穿梭于核仁、核质和胞质之间，参与核糖体前体运输和合成及中心体的复制，进而调控细胞的周期进程和增殖发育[1]。人类NPM1基因位于染色体5q35，基因全长约23kb，含有12个外显子，编码由294个氨基酸组成的蛋白质。在分子结构上NPM可分为3个区域，分别负责不同的功能[2]，由N端开始，NPM蛋白包含一个疏水区，它参与寡聚化过程，并与NPM分子伴侣活性相关。随后2个富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性区，是与组蛋白结合的关键结构。在两个酸性区是核糖核酸酶活性区，与C端的核酸结合结构域一起构成核糖核酸酶活性结构域。NPM主要定位在核仁颗粒区，可通过核仁定位信号在核仁、胞核和胞质之间往返，参与核质间物质的运输。

NPM具有多种生物学功能。一方面，NPM在rRNA前体加工过程中发挥核糖核酸内切酶的活性，参与28S rRNA的形成，进而促进核糖体的形成，同时NPM可作为细胞周期依赖性蛋白激酶2（CDK2）/细胞周期蛋白E复合物的直接底物，被CDK2/cyclin E磷酸化，并从中心体中解离出来，启动中心体复制，在调控周期进程和促进细胞增殖中发挥着重要作用。另一方面，NPM可以与HIV-Rev等带有核定位信号的蛋白质结合，促进它们运输至核仁并阻止核仁内多种蛋白质的聚集，还可以结合组蛋白，介导核小体的合成和致密染色质的舒展，发挥分子伴侣功能[3]。

2 NPM1突变发现及突变类型

Falini等[4]首先通过免疫组织化学方法对591例AML患者NPM基因表达的研究中发现，其中208例患者 （占35.2%）白血病细胞胞浆中检出NPM蛋白，NPM基因突变导致大量的NPM分子从核仁移位至胞浆，因此把基因突变致NPM胞浆移位的白血病细胞称之为NPMc+细胞。这种 NPMc+细胞分布在除 M3、M4EO、M7以外的其它 AML FAB各亚型中，但在不同FAB亚型中突变率不同，如M2中约为20%，M4中为40%～50%，M5a中为40%～50%，M5b中则高达90%。可见，其与单核细胞关系较为密切[5]。经测序证实为NPM1基因第12外显子突变导致NPM蛋白核定位改变。

NPM突变的类型：NPM突变基因是杂合型的，在基因座上保留了1个野生型的等位基因。目前发现有多种NPM1基因突变，都是由在外显子12的不同位置插入不同的核苷酸而产生，主要以6种变异体（mutation A-F）为主，其中最常见的是mutation A，它是在野生型NPM核苷酸序列第956-959位上插入1个TCTG 4个核苷酸而形成串联重复序列；mutation B、C、D是在野生型NPM核苷酸序列上第960位之前插入4个不同碱基而产生；而mutation E、F是由于缺失了野生型NPM核苷酸序列第965-969位上的GGAGG碱基序列，但随后插入了2种不同的9个碱基的序列而产生[6]。 Mutation A-F导致NPM1基因外显子12的移码突变，使NPM蛋白C末端的7种氨基酸色（W）-谷（Q）-W-精（R）-赖（K）-丝（S）-亮（L）被 11 个短肽链X-X-X-X-X-X-缬 （V）-S-L-R-K或13个短肽链 W-Q-天冬（D）-苯丙（F）-L-门冬（N）-R-L-F-K-K-异亮（I）-V所代替，从而导致NPM蛋白C端的288和290位点上至少有1个色氨酸发生突变而产生一个核输出信号（NES），最终使NPM移位到胞浆。

Nakagawa等[7]进一步研究提出，在野生型NPM分子结构中C端的色氨酸只对NPM的核仁定位起主要作用，而对NPM的胞浆移位不起主要作用；他同时还提出在突变NPM的C端中存在一种核输出信号序列（NES），由疏水性氨基酸残基所组成。NES中的分子被输出信号受体CRM1所识别，从而产生核输出信号，导致NPM移位到胞浆。在野生型NPM的N端92-104位点有一个生理性的NES序列，若将此NES序列敲除或将C端突变产生的NES序列敲除，然后将NES序列敲除的NPM基因转染入NIH3T3细胞，发现无论敲除N端还是C端的任意一种NES序列，NPM都只能出现在核质而不能聚集在胞浆中，这说明突变NPM只有在同时具有两种NES序列的情况下才能实现其胞浆的聚集。

3 NPM1突变检测

关于NPM1突变的检测，目前应用的主要方法有PCR-毛细管电泳、变性高效液相色谱（DHPLC）、直接测序、实时荧光定量PCR（Q-PCR）以及免疫组化检测胞浆中NPM蛋白等方法[9，12]，这几种检测方法各自有其优缺点。近年来DHPLC、毛细管电泳和RQ-PCR作为检测基因突变方法，以其灵敏度高、自动化、快速高效、准确等优势渐渐成为各种基因突变检测方法中常用的可靠方法。直接测序作为检测基因突变的“金指标”，随着灵敏度不断提高、检测的成本进一步降低，该方法也逐渐普及。

DHPLC：是在PCR产物的基础上进行的。NPM1基因突变为杂合子，PCR扩增的基因不仅包括突变基因，还包括未突变等位基因。如果正常基因和突变基因在试管内变性杂交，DHPLC的图谱上会出现有别于正常基因的构象，出现不同的峰型，由此可以辨别是否有突变。Roti等[8]认为该方法检测突变高度敏感、可靠，并且只需对PCR产物直接检测，因而快速廉价。但邹积艳等[9]发现，DHPLC检测结果受较多因素影响，虽然多次更换条件，部分突变患者的峰型并不典型，最终的判断很容易出现假阴性。

毛细管电泳：是在基因序列分析仪上做毛细管电泳检测来分析PCR基因产物[10]。毛细管电泳法是用荧光标记PCR产物，观测PCR获得的基因片段在毛细管电泳图上显示的长度，还可根据峰面积定量检测突变型与野生型的比率。并且需要的样本量很小，可对多重PCR产物同时检测而不影响结果的准确性，但是，毛细管电泳要求扩增产物不能太长（一般＜500bp），否则会影响其准确性，另外该方法需要价格昂贵的基因序列测定仪。作为一种快速的定性检测方法，毛细管电泳具有很大的优势。

Q-PCR：可以精确地做基因定量，从而估计突变细胞在患者体内的数量。Q-PCR基因定量往往用于检测治疗后的白血病微小残留病（MRD）。临床治疗要求检测MRD的灵敏度达到恶性细胞占1/105～1/106个细胞的水平，并且要求快速、价廉、易于标准化质量控制，在不同实验室可以重复。Q-PCR完全可以达到要求，使临床工作中对患者不同病期、不同实验室的检测结果有了可比性[12]。Q-PCR有多种模式：Taqman探针法、荧光染料法、分子信标法等，但Q-PCR只能针对NPM1已知基因突变类型检测。

PCR产物的直接测序：是检测基因突变的“金指标”。其往往受到基因组DNA同时存在正常（野生型）等位基因和突变等位基因片段混杂在一起的影响，需要对PCR产物进行凝胶纯化，步骤较繁琐，而且突变基因含量较低时，直接测序往往很难检测到突变，灵敏度相对较低。

免疫组化：该方法简便易行，可同时观察细胞形态及分布，适用于标本取材较少或髓外组织活检等情况。有3种抗体可用于NPM的免疫组化检测[13]。一种为标记NPM的单克隆抗体，但其不能区分NPM突变型与野生型，只能通过其细胞定位（野生型位于细胞核，突变型位于胞浆）区分。此种抗体目前应用最广泛。另一种为多克隆抗体，可识别NPM突变型，但其诊断敏感性仅为50%～60%，因其高度特异性而主要应用于NPMc+AML细胞系研究。第3种单克隆抗体只识别野生型NPM，此种单克隆抗体诊断意义不大。Falini等[13]分析200例NPM1基因突变患者，通过免疫组化方法检测NPMc+，其中195例呈强阳性，5例呈弱阳性。对照250例野生型NPM1均为阴性。其缺点是不能准确定量，对NPM1阴性检测缺乏准确性。

另外，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳也是检测NPM1突变的一个比较好的方法，在普通聚丙烯酰胺凝胶中加入变性剂如尿素等，可去除单链DNA的构象变化，使电泳的单链迁移率只由DNA的长度决定，从而可以分辨不同DNA标本间的细微碱基数量差别。

4 NPM1检测的临床意义

Thiede等[14]进行的大规模临床研究结果显示，在1485例AML患者中有408例（27.5%）存在4个核苷酸插入的NPM1突变，并且发现了13种新突变。核型正常者NPM1突变发生率（45.7%）明显比核型异常者（8.5%）高，且表现为骨髓中原始细胞比例高、高白细胞和血小板，髓外浸润易见。进一步研究发现，在成人女性AML患者，NPM1突变发生率比男性患者要高1.5倍，提示存在性别差异。在儿童AML患者中，NPM1的发生率为2.1%～6.5%，在儿童AML-NK 患者发生率为 9%～26.9%[15，16]，而在成人 AML 患者中为25%～35%，在成人AML-NK患者中则高达45.7%～63.8%[17]，表明在儿童AML中NPM发生突变的可能性比成年病例要低得多。值得注意的是，儿童AML患者往往出现NPM-mtA以外的突变型，他们在性别和白细胞计数方面与NPM-wt患者没有显著的差异。

NPM1突变在慢性粒细胞白血病患者中并不常见。Caudil等[18]研究发现，在CML患者中一旦出现了NPM1突变，提示CML极有可能短期内迅速发展为AML，患者预后较差。Zhang等[19]在38例原发性骨髓增生异常综合征患者中，发现2例NPM1突变，分别是难治性贫血（RA）和难治性贫血伴原始细胞增多。这2例患者虽表现异常核型，但均未涉及NPM1所在的5号染色体的改变。

关于在中国AML人群中NPM1的发病率，2个研究发现[20，21]，中国 AML患者 NPM1突变率分别为 16.4%与28.2%，前者应用Q-PCR的方法，主要检测的是NPM1A、B、D型突变，而后者采用的是毛细管电泳的方法，筛查NPM1所有类型突变。相对于国外研究，NPM1在中国AML患者发生率明显低于国外。

Schnittger等[22]提出，可以把 NPMc+作为 AML预后良好的因素之一。然而，NPM1突变近40%的AML患者同时存在NPM1和FLT3-ITD基因突变，而在药物诱导AML缓解的试验中，发现FLT3-ITD突变能降低完全缓解率，因此单纯NPMc+的AML患者预后较好，若同时伴随FLT3-ITD突变，将会影响AML患者对化疗药物诱导的缓解效果[23]。Koh等[24]认为，FLT3-ITD阴性、预后良好的NPM1突变是在956-959位点具有经典TCTG插入的A型，其他非A型突变患者的中位生存期和总生存期较A型突变患者短。

另外，研究发现NPM1突变可以作为监测MRD的新指标。利用Q-PCR检测突变NPM基因cDNA拷贝数，从而监测MRD。在13例NPM1突变的AML患者中，突变NPM1基因cDNA拷贝数均＞30000。药物治疗后，其中10例获得明显缓解，其突变NPM1基因cDNA的拷贝数明显下降，而药物治疗无效的3例患者其突变NPM基因cDNA拷贝数下降程度很小或不下降。这表明突变NPM基因cDNA拷贝数与患者的临床状况明显相关[7]。NPM1基因突变稳定，对2组AML复发者的研究发现，17例患者中的15例和15例患者中的10例NPM1基因突变持续存在[25]。通过定量PCR检测NPM1基因突变，显示其稳定性与疾病临床进程密切相关[26]。因此，NPM1基因检测可用于治疗后监测疾病复发及微小残留病变检测。

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