生长因子在颅缝早闭症中作用的研究进展

唐冬生 综述 韦敏 审校

原发性颅缝早闭是常见的先天性颅面畸形，可发生于一条或多条颅缝，表现为颅腔狭小、三角头、舟状头、斜头或颅面畸形综合征等。不仅造成颅骨畸形，而且可导致颅内压升高、视乳头和视盘水肿、视敏度受损、视神经萎缩失明，严重者脑发育受阻，影响患儿智力发育[1]。

目前，国内外在细胞、分子甚至基因水平对原发性颅缝早闭的机理进行了广泛研究，认为颅骨、颅缝发育成熟与大脑组织、硬脑膜和颅盖骨之间复杂的相互作用有关。一旦颅缝周围的微环境发生变化，或基因遗传的改变干扰了生长发育体系，就可能导致颅缝的早期闭合。研究发现，硬脑膜在颅缝闭合中可能有重要作用。1851年，Rudolph指出，颅缝的闭合并不依赖于脑内的环境；1920年，Park和Powers推测，由于胚胎阶段某种颅缝间质成分的缺陷，导致了颅缝早闭；Moss也在1959年提出，作为颅脑张力的传导者，硬脑膜明显影响颅缝的闭合。有研究将胚胎大鼠的冠状缝异位植入同种的成熟大鼠的颅骨，在排除硬膜生化环境的影响下，观察冠状缝生长变化，发现移植颅缝形态学的生长变化与在有硬膜的生化环境下的正常形态不同。Roth等[2]将一种不渗透的硅胶膜植入刚出生的SD大鼠后额缝的硬脑膜与颅骨之间，结果发现，SD鼠后额缝延迟到30 d后才闭合（正常12～22 d闭合），而未植入者则正常闭合。

随着在分子水平上研究的不断深入，证实了相关生长因子及相应通路在颅缝闭合中发挥着重要的作用，但其作用的具体机制及各因子之间的相互作用情况目前仍不清楚。以下就目前几种研究较多的相关生长因子及其作用通路在颅缝早闭症中的研究进展加以阐述。

1 相关生长因子

目前的研究表明，成纤维细胞生长因子（FGFs）、转化生长因子（TGF-βs）与颅缝闭合过程有着密切的关联,有研究认为TGF-β在颅缝闭合中主要起调节FGFs及其受体表达水平的作用[3-5]。在早闭的鼠后额缝和宫内头部受压产生颅缝早闭的小鼠模型研究中发现，FGF2和TGF-β1共同高表达，在后位斜头畸形和单侧冠状缝早闭中，TGF-β亚型的质量增加；在多个以颅缝早闭为特征的综合征（Crouzon综合征、Apert综合征和Pfeiffer综合征）中发现，FGF2受体的功能获得性突变；Traynis等[6]报道在一例孤立的双侧冠状缝早闭的病例中发现，FGFR2基因存在异常的剪接位点的突变，均提示FGF、TGF-β信号转导在颅缝早闭中发挥重要的作用。

FGFs是一类生长因子超家族，它在颅缝闭合过程中起着重要的调控作用。其信号转导途径有ERK/MAPK途径、p38MAPK途径、JNK途径等。其中，ERK途径在骨细胞的增殖和分化中起着主要的作用[7]。FGF-2最初从脑组织中得到，呈碱性，被证实在鼠类的纤维母细胞中有明显的促增殖活化作用，主要在未成熟鼠的间质细胞、输精管周围细胞、足细胞中表达，并随着性成熟而逐渐减少。Spector等[8]将SD幼鼠颅缝的硬脑膜细胞及成骨细胞共同培养，并防止两者产生接触抑制。在共培养中发现，成骨细胞的增殖明显强于硬脑膜细胞，认为是硬脑膜细胞可分泌FGF-2、TGF-β1和骨钙素等，对成骨细胞产生旁分泌作用而引起的。Moore等[9]在鸡胚胎的颅盖穹隆游离组织中，分别加入正常生理学浓度的FGF-2因子、高浓度FGF-2因子及抗体，以控制鸡胚胎的颅穹隆部的FGF-2配体水平，来干扰颅骨的正常形态学演变。研究发现，尽管生理水平浓度的FGF-2能引起鸡胚胎的肢体形态学改变，但不足以引起颅穹隆发育的形态学改变；高于正常生理浓度的FGF-2则导致细胞明显增殖，使组织形态增大；当FGF-2的浓度进一步增大时，则出现细胞增殖分化的闭锁。所以，他们认为，FGF-2的浓度强度变化引起的相关信号通路可控制颅盖发育中与FGF相关的成骨细胞的增殖、分化。其他体外研究也显示，在不同的培养条件下，FGF信号或者能够增强成骨细胞的增殖[10]，或者能够随着细胞凋亡而减弱成骨细胞的增殖[11]。

同时，FGF受体（FGFRs）也是引起各种先天颅缝早闭综合征的重要因素。FGFs（1～4）是单跨膜酪氨酸激酶的受体的一部分，每一个受体由一个胞外配体结合区、一个跨膜区和一个胞内激酶区域组成。3个免疫球蛋白形成3个环状链（ⅠgⅠ，ⅠgⅡ和ⅠgⅢ），每个环状链有一个二硫键、一个酸性区和一个细胞黏附因子（CAM），位于ⅠgⅠ和ⅠgⅡ之间。当FGF配体与HSPGs（硫酸乙酰肝素糖蛋白）和/或HS（硫酸乙酰肝素）结合，并与FGFR通过二聚作用和自磷酸化作用形成三分子复合物，即可向胞内传递有效信号。而持续激活FGFs及后续的信号上调作用可导致颅缝过早闭合。大量文献报道认为，该点突变或缺失可导致多种颅缝早闭畸形，可能与FGF/FGFR信号转导异常有关。FGFR突变与多种颅缝早闭综合征有关，大多数突变来源于FGFR2，最早于1994年发现Crouzon综合征与FGFR2突变相关[12-13]，随后发现其他一些颅缝早闭综合征（包括Apert综合征、Pfeiffer综合征）与FGFR2突变相关[14-15]；部分来源于 FGFR3，如 Crouzon综合征、Muenke综合征与 FGFR3突变相关[16-17]；FGFR1突变与Pfeiffer综合征相关[18]。迄今为止，尚未发现FGFR4突变与颅缝早闭明显相关。

TGF-β是二聚体多肽生长因子家族的一员，最初是从病毒转染的鼠细胞隐匿分泌的蛋白中发现的。TGF-β仅有单一特定的细胞表面受体，能促进纤维母细胞的有丝分裂，在不同的环境下对细胞的生长有促进或抑制的双重作用。在颅缝闭合过程中，TGF-β、TGF-βR在成骨细胞中高表达。TGF-β对于信号的转导主要是通过Smads蛋白来介导的，形成Smads蛋白磷酸化复合物后核转位，与DNA结合后调控细胞增殖和分化。Smad蛋白家族是近年发现的新的细胞内信号转导蛋白，直接参与TGF-β超家族成员，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 及骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）、活化素（Activin）等多个成员的信号转导[19-20]。Smad蛋白最早是通过基因筛查在无脊椎动物中鉴定出来的。Sekelsy等[21]分离出Mad蛋白，Savage等鉴定出Sma基因，它与Mad蛋白密切相关。Caenorhabdjtis在对果蝇的研究中发现，Mad蛋白和Sma蛋白作用于丝氨酸/苏氨酸激酶受体下游。因此，将Mad和Sma蛋白及其类似物统称为Smad（Sma-Mad）族蛋白。

颅缝早闭是一个复杂的病理生理过程，是多因素、多因子参与，网状交互作用的复杂过程。生长因子FGF2和TGF-β1在颅缝早闭中同时出现的高表达对于颅缝早闭的意义，及其相互之间尤其是其通路ERK/Smad间有无协同或抑制作用，其具体作用机制仍不十分清楚。

在生长因子方面，有研究认为，TGF-β在颅缝闭合中主要起调节FGFs及其受体表达水平的作用。在颅缝早闭机制中，相对FGFs，TGF-β可能作为第二要素存在，是颅缝闭合复杂机制的一个组成部分，辅助调控颅缝的闭合[22]。HanJoon等[23]发现，单纯TGF-β1腺病毒过表达能促进骨形成，但不会导致鼠的病理性矢状缝早闭。Spector等[24]发现，在颅缝闭合过程中，FGF2和TGF-β1共同作用小鼠硬脑膜细胞时，FGF2 mRNA的水平上升7倍而TGF-β1上升3倍。Mukherjee等[25]通过鼠的离体跖骨培养试验发现，在加入TGF-β培育后，FGFR磷酸化水平增高，FGF信号转导分子水平升高，对颅缝的闭合产生正向调节的作用。

2 相关生长因子的作用通路

在通道水平方面，曾经认为各通路之间是平行的、线性的关系，但现在越来越多的研究表明，ERK通路与Smads通路间存在着网状的复杂的密切联系，其相互作用可存在于受体、信号转导途径上各分子及转录因子等各水平。

ERK及其下游分子与Smad通路间的相互影响在各类细胞中均存在，但其交互作用在各细胞中产生的结果却并不完全相同，具有明显的细胞特异性。在人肾小球系膜细胞中，MEK/ERK被抑制后，不仅TGF-β诱导的Smad2/3的量明显减少，而且细胞合成Ⅰ型胶原也减少；但在同样的实验条件下，在鼠乳腺上皮细胞内，MEK/ERK抑制剂对Smad2/3的活性没有影响[26]。在骨细胞方面，Sowa等[27]通过对鼠成骨细胞的研究发现，ERK通路激活对于Smad3诱导的碱性磷酸酶及骨钙化具有负性调节作用，并可进一步调节骨形态和骨密度。Yin等[28]发现，当ERK通路阻断后，由FGFR2基因上的片断pro253Arg突变引起的颅面畸形可以得到明显的缓解。此外，相关研究还表明，ERK下游分子AP-1可能参与Smads复合物与DNA相应片段结合过程并起着重要的调节作用[5]。而在颅缝闭合过程中，ERK通路对于Smads蛋白作用的细胞特异性如何，是协同还是抑制，对于颅缝处细胞的增殖和分化有何影响仍未得知。

目前认为，Smads对于ERK通路的作用及机制，不同的细胞、不同的阶段，ERK/MAPK通路的激活，可能需要Smads的不同表达。在人永生化支气管上皮细胞BEP2D细胞中Smad4沉默后，TGF-β3 ERK激酶的磷酸化水平下降[29-30]。而在对鼠未分化肠上皮细胞的研究中发现，Smad3/4的缺失会严重抑制ras-mkk-mek-erk的MAPK途径所诱导的TGF-β1的表达[31]。而在颅缝早闭中，TGF-β1辅助FGF2诱导颅缝闭合是否需要Smads蛋白的作用，其作用是协同还是抑制，其缺失对于颅缝早闭有何影响，目前尚不明确。

综上可知，FGF2/ERK和TGF-β/Smads两条信号转导通路之间存在着复杂的相互调节关系，在颅缝早闭的发病中起着重要的作用。但二者交互调节的许多机制仍不清楚。

最近发现，在Apert综合征中，FGFR2下游区的表皮生长因子受体（EGFR）和血小板衍生生长因子受体（PDGFR-α）通过PKC-α依赖的激活蛋白-1（AP-1）转录活性的活化而表达增强[32]，提示这两种因子在颅缝早闭中同样发挥着一定的作用。此外，胰岛素样生长因子1受体(IGFR1)的变异可能促进或者造成单个的颅缝过早闭合[33]。

3 展望

目前的研究已明确，FGFR和TGF-β介导的信号系统在颅缝过早闭合的发病机理中起着关键作用。正常的颅缝闭合依赖于复杂的信号级联系统，而这些信号系统可以受到许多遗传突变及细胞内信号干扰的破坏，从而导致颅缝早闭的发生。目前对于颅缝闭合的生长因子调控机制研究很多，但是具体作用机制及各机制之间的相互关联仍未十分清楚。深入理解生长因子如何影响颅缝闭合，将有助于颅缝早闭症的预防及治疗。

[1]张涤生.颅面外科学[M].上海:上海科学技术出版社,1997.

[2]Roth DA,Bradley JP,Levine JP,et al.Studies in cranial suture biology:partⅡ.Role of the dura in cranial suture fusion[J].Plast Reconstr Surg,1996,97(4):693-699.

[3]Gosain AK,Recinos RF,Agresti M,et al.TGF-beta1,FGF-2,and receptor mRNA expression in suture mesenchyme and dura versus underlying brain in fusing and nonfusing mouse cranial sutures[J].Plast Reconstr Surg,2004,113(6):1675-1684.

[4]Crane NJ,Morris MD,Ignelzi MA,et al.Raman imaging demonstrates FGF2-induced craniosynostosis in mouse calvaria[J].J Biomed Opt,2005,10(3):031119.

[5]Xu Y,Malladi P,Chiou M,et al.Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro[J].Plast Reconstr Surg,2007,119(3):819-829.

[6]Traynis I,Bernstein JA,Gardner P,et al.Analysis of the alternative splicing of an FGFR2 transcript due to a novel 5'splice site mutation(1084+1G>A)[J].Cleft Palate Craniofac J,2012,49(1):104-108.

[7]Kim HJ,Lee MH,Park HS,et al.Erk pathway and activator protein 1 play crucial roles in FGF2-stimulated premature cranial suture closure[J].Dev Dyn,2003,227(3):335-346.

[8]Spector JA,Greenwald JA,Warren SM,et al.Co-culture of osteoblasts with immature dural cell causes an increased rate and degree of osteoblast differentiation[J].Plast Reconstr Surg,2002,109(2):631-642.

[9]Moore R,Ferretti P,Copp A,et al.Blocking endogenous FGF-2 activity prevents cranial osteogenesis[J].Dev Biol,2002,243(1):99-114.

[10]Lomri A,Lemonnier J,Hott M,et al.Increased calvaria cell differentiation and bone matrix formation induced by fibroblast growth factor receptor 2 mutations in Apert syndrome[J].J Clin Invest,1998,101(6):1310-1317.

[11]Mansukhani A,Bellosta P,Sahni M,et al.Signaling by fibroblast growth factors(FGF)and fibroblast growth factor receptor 2(FGFR2)-activating mutations blocksmineralization and induces apoptosis in osteoblasts[J].J Cell Biol,2000,149(6):1297-1308.

[12]Preston RA,Post JC,Keats BJ,et al.A gene for Crouzon craniofacial dysostosis maps to the long arm of chromosome 10[J].Nat Genet,1994,7(2):149-153.

[13]Reardon W,Winter RM,Rutland P,et al.Mutations in the fibroblast growth factor receptor 2 gene cause Crouzon syndrome[J].Nat Genet,1994,8(1):98-103.

[14]Meyers GA,Day D,Goldberg R,et al.FGFR2 exonⅢa andⅢc mutations in Crouzon,Jackson-Weiss,and Pfeiffer syndromes:evidence for missense changes,insertions,and a deletion due to alternative RNA splicing[J].Am J Hum Genet,1996,58(3):491-498.

[15]Ruland P,Pulleyn LJ,Reardon W,et al.Identical mutations in the FGFR2 gene cause both Pfeiffer and Crouzon syndrome phenotypes[J].Nat Genet,1995,9(2):173-176.

[16]Meyers GA,Orlow SJ,Munro IR,et al.Fibroblast growth factor receptor 3(FGFR3)transmembrane mutation in Crouzon syndrome with acanthosis nigricans[J].Nat Genet,1995,11(4):462-464.

[17]Muenke M,Gripp KW,McDonald-McGinn DM,et al.A unique point mutation in the fibroblast growth factor receptor 3 gene(FGFR3)defines a new craniosynostosis syndrome[J].Am J Hum Genet,1997,60(3):555-564.

[18]Muenke M,Schell U,Hehr A,et al.A common mutation in the fibroblast growth factor receptor 1 gene in Pfeiffer syndrome[J].Nat Genet,1994,8(3):269-274.

[19]Arai T,Akiyama Y,Okabe S,et al.Genomic structure of the human smad3 gene and its infrequent alterations in colorectal cancers[J].Cancer Lett,1998,122(1-2):157-163.

[20]Zhang Y,Feng X,We R,et al.Receptor-associated Mad homologues synergize as effectors of the TGF-β response[J].Nature,1996,383(6596):168-172.

[21]Sekelsky JJ,Newfeld SJ,Raftery LA,et al.Genetic characterization and cloning of mothers against dpp,a gene required for decapentaplegic function in Drosophila me1anogaster[J].Genetics,1995,139(3):1347-1358.

[22]Cohen MM Jr.TGF-β/Smad Signaling System and its pathologic correlates[J].Am J Med Genet A,2003,116A(1):1-10.

[23]HanJoon MS,Randall N,Kenton F,et al.TGF-beta1 adenoviral overexpression increases osteogenesis but does not lead to pathologic murine sagittal craniosynostosis[J].J Am Coll Surg,2004,199(3):48.

[24]Spector JA,Greenwald JA,Warren SM,et al.Dura mater biology:autocrine and paracrine effects of fibroblast growth factor-2[J].Plast Reconstr Surg,2002,109(2):645-654.

[25]Mukherjee A,Dong SS,Clemens T,et al.Co-ordination of TGF-β and FGF signaling pathways in bone organ cultures[J].Mech Dev,2005,122(4):557-571.

[26]Hayashida T,Decaestecker M,Schnaper HW.Cross-talk between ERK MAP kinase and Smad signaling pathways enhances TGF-beta-dependent responses in human mesangial cells[J].FASEB J,2003,17(11):1576-1578.

[27]Sowa H,Kaji H,Yamaquchi T,et al.Activations of ERK1/2 and JNK by transforming growth factor β negatively regulate Smad3-induced alkaline phosphatase activity andmineralization in mouse osteoblastic cells[J].J Bio Chem,2002,277(39):36024-36031.

[28]Yin L,Du X,Li C,et al.A Pro253Arg mutation in fibroblast growth factor receptor 2(Fgfr2)causes skeleton malformation mimicking human Apert syndrome by affecting both chondrogenesis and osteogenesis[J].Bone,2008,42(4):631-643.

[29]Mulder KM.Role of Ras and Mapks in TGFbeta signaling[J].Cytokine Growth Factor Rev,2000,11(1-2):23-35.

[30]何欣蓉,霍艳英,胡迎春,等.Smad4分子在ERK/MAPK信号转导通路中的作用[J].中国生物化学与分子生物学报,2006,22(4):333-337.

[31]Yue J,Mulder KM.Requirement of Ras/MAPK pathway activation by transforming growth factor beta for transforming growth factor beta 1 production in a Smad-dependent pathway[J].J Biol Chem,2000,275(40):30765-30773.

[32]Miraoui H,Ringe J,Haupl T,et al.Increased EFG-and FDGFalpharecepor signaling by mutant FGF-receptor 2 contributes to osteoblast dysfunction in Apert craniosynostosis[J].Hum Mol Genet,2010,19(9):1678-1689.

[33]Cunningham ML,Horst JA,Rieder MJ,et al.IGF1R variants associated with isolated single suture crniosynostosis[J].Am J Med Genet A,2011,155A(1):91-97.