微小RNA和衰老

高琴琰, 房静远

（上海交通大学医学院附属仁济医院消化疾病研究所, 上海 200001）

随着社会逐步步入老龄化, 衰老问题日益受到人们的重视。机体各系统的功能会随着年龄的增长而不断下降, 直至最终衰老、死亡, 在这个复杂的生物过程中, 衰老始终受到多个因素的共同作用。微小RNA（microRNA, miRNA）是一类大小约21～23个碱基的非编码单链小分子RNA, 它们广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中[1]。既往研究表明, 它们在生物体内不仅仅是代谢的产物, 而且是机体有目的编码RNA的重要调控分子, 参与生物体的生长、发育、衰老和死亡的调控。2005年, 耶鲁大学的研究小组以线虫作为研究对象, 利用lin-4以及lin-4的调控靶基因敲除实验发现, 突变型线虫的寿命要明显短于正常线虫, 并且过量表达lin-4也可以延长线虫的寿命。这一研究除了说明miRNA在阻止细胞过早死亡过程中能发挥作用, 同时也为miRNA调控生长发育和衰老的生物钟机制提供了强有力的证据[2]。目前已经认识到miRNA能调节干细胞分化, 促进组织再生, 并在体外调控细胞衰老[3],而且也明确了在不同物种, 包括蠕虫、果蝇、小鼠和人类中存在着很多相同的进化保守的miRNA[4],但是却不清楚在人类的衰老和相关疾病中这些miRNA是否与在蠕虫中发挥的作用一致。

那么究竟有哪些miRNA参与了衰老这个过程,它们又是通过那些途径来调控衰老的呢？本文将对相关内容作一综述。

1 miRNA和h-TERT表达

人类染色体端粒由进化上高度保守的重复序列TTAGGG组成, 由端粒酶合成, 是维持染色体稳定的重要因素。随着细胞分裂次数的增加, 端粒不断缩短。这就是细胞衰老的端粒假说。端粒酶是一种核蛋白, 能够利用其自身的RNA亚基作为模板, 端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase, TERT）将端粒核苷酸重复序列加到染色体末端, 从而维持端粒的结构和长度。

随着miRNA成为基因表达调控中研究热点,miRNA在端粒酶表达调控中的作用也逐渐被认识。Mitomo等[5]在研究中发现, miR-138表达与h-TERT的表达呈负相关, 在低分化甲状腺癌细胞中, 外源性过表达miR-138可明显下调h-TERT表达, 并且转染miR-138前体分子可抑制连接有h-TERT 3'非翻译区（untranslated regions, UTR）的报告载体的荧光素酶表达活性, 由此他们推测, miR-138与h-TERT的mRNA 3'UTR靶点结合可以阻碍mRNA的有效翻译, 从而下调h-TERT表达, 最终抑制低分化甲状腺癌细胞端粒酶活性。该项研究尽管没有达到显著性差异, 但还是为这一途径提供了新的研究方向。同样, Miura等[6]研究发现, 在胶质母细胞瘤A172细胞、中度分化肝细胞癌HMc-Li7细胞和低分化肝癌HLF细胞中, RGM249（编码miRNA前体基因）的表达可抑制h-TERT基因转录, 降低h-TERT mRNA水平。另外, Bonifacio等[7]在人类包皮成纤维细胞BJ以及能稳定表达人端粒酶逆转录酶亚基h-TERT的永生化成纤维细胞BJ-hTERT中使用miRNA基因芯片进行分析, 结果提示, miR-143在年轻的成纤维细胞中存在异位表达, 能够诱导细胞生长停滞。值得注意的是, miR-143不能诱导BJ-hTERT细胞的生长停滞。该小组同样报道了miR-146a也是一个独立的、通过分泌途径来调控细胞衰老的因素[7]。

但是目前的研究结果仅仅提示我们, miRNA可能对h-TERT起到调控, 但还没有研究阐明miRNA是通过怎样的机制来发挥调控作用的, 而且, 大部分的研究尚局限于肿瘤细胞内进行, 并没有太多来自于正常细胞的研究。因此, 对于miRNA如何通过h-TERT来调控端粒酶从而进一步调节衰老还有待于后续的研究。

2 miRNA和p53信号通路

既往研究已知, 肿瘤抑制因子p53和其相关网络能够对多种癌症相关应激信号产生应答, 这些信号包括DNA损伤、端粒酶缺失、癌基因激活、细胞因子信号亢进及缺氧等[8]。p53激活的结果取决于应激的类型和应激强度, 可能导致细胞周期停滞、细胞衰老和凋亡。由于p53激活后, miRNA的表达也被激活, 所以miRNA有可能对p53的功能效应具有重要作用, 由此通过该信号通路来调节细胞的衰老。

近几年来研究相对较多, 且最为代表性的miRNA应属miR-34。Tarasov等[9]在骨肉瘤细胞中发现miR-34可以使细胞停滞在G1期, 同时S期细胞减少,起到细胞周期阻滞作用。之后的学者也通过细胞周期和免疫杂交检测证明, miR-34造成的G1期阻滞是通过其对细胞内细胞周期蛋白（cyclin D1）、细胞周期素依赖激酶（cyclin dependent kinase 6, CDK6）以及其他一些miR-34a的靶蛋白的抑制来实现的[10]。另一些研究发现, 将miR-34a及miR-34b/c导入人类成纤维细胞中进行异位过表达时, 约60%的受转染细胞会出现形态学和分子水平细胞老化[11,12]。同样,Tazawa等[13]将miR-34a转染入人类结肠癌HCT116细胞、RKO细胞和p53突变的SW480细胞后, 发现细胞体积增大且衰老, 衰老相关的半乳糖苷酶试验呈阳性, 表明miR-34a可以诱发细胞衰老。但是在大多数肿瘤细胞系中, miR-34a的过表达效应表现为细胞凋亡的增多[14-16]。Dalgard等[17]在视网膜母细胞瘤细胞中进行了细胞生长实验和活化的caspase3细胞凋亡的活性分析, 发现miR-34s的抑制生长功能可以在肿瘤细胞中重新激活, 促使caspase3和PARP的裂解, 诱发caspase调控的凋亡途径。有趣的是, 在结肠癌HCT116细胞系中, miR-34a过表达的主要效应是在转染48 h后出现细胞生长停滞[11], 但在转染72 h后则发生细胞凋亡[11,18]。

多数研究表明miR-34与p53呈现正相关, 而在该家族中, 当属miR-34a与p53关系最为密切。miR-34参与p53介导的细胞凋亡或细胞周期调控网络可能是通过相关的靶蛋白, 细胞因子CDK4,CDK6, Cyclin E2, E2F3, E2F5, Met, Bcl-2 及原癌基因c-myc等发挥作用的[9,19-23], 由这些靶蛋白参与p53调控网络从而调控细胞的生长和凋亡。但值得注意的是, 这些调控机制并不是简单的线性相关,而是可以形成反馈机制来进行调节。例如Timmers等[24]发现, 转录因子E2F1, E2F2, E2F3的激活是由依赖p53的反馈轴控制, 间接调节E2F所介导的转录抑制和细胞增殖; Sharma等[25]也证实, E2F1-3因子通过负反馈调节p53-p21轴, 从而对细胞周期和转化进行调节。

因此, 尽管对于miR-34家族在p53通路中下游的靶蛋白的认识比较多, 也初步描绘了调控的机制和网络, 但是由于细胞周期调控的复杂性, 我们还不能全面地阐明整个调控网络的结构, miR-34如何通过靶蛋白从而进一步调控衰老仍然处于探索阶段。

除了miR-34家族之外, 还有很多miRNA与p53通路有关。2010年, Wang等[26]在人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38中, 通过电离辐射诱导细胞早衰, 通过基因芯片确定有8个miRNA在这些早衰细胞中表达, 分别是4个上调的miRNA（miR152, miR410,iR431和miR493）和4个下调的miRNA（miR155,miR20a, miR25和miR15a）。而这些miRNA可能是通过调节p53和p38下游丝裂原活化蛋白激酶通路, 从而调节p53诱导核蛋白1发挥作用的[26]。Sharma等[27]研究发现在肝细胞中, miR221可以高度上调并存在异位表达, 由此保护肝细胞和肝癌细胞, 防止其凋亡。这一功效是通过Bcl2蛋白家族预凋亡成员, p53上调凋亡控制器PUMA蛋白所发挥的。Ory等[28]在人类和小鼠鳞癌细胞中均发现miR193a受到p53的相关转录因子, p63和p73基因的调控, 可被p63抑制,被预凋亡p73基因亚型激活, 从而改变细胞的化疗敏感性和细胞增殖及存活能力。而Afanasyeva等[29]提出, 在神经母细胞瘤细胞中miR885-5p的表达可以抑制细胞增殖, 从而引起细胞生长周期停滞、衰老和（或）凋亡。miR885-5p可以导致p53蛋白的聚集并激活该途径, 最终上调p53的靶向目标。Xiao等[30]发现miR605是p53基因网络的一个新成员。在细胞应激反应中, p53基因逃逸的p53-Mdm2的负反馈迅速积累可以引起细胞周期停滞和细胞凋亡, 而miR605的转录与后转录和p53与Mdm2相关, 并且可以干扰p53-Mdm2的互相作用, 形成一个正反馈以促进p53快速聚集。其他可能与p53有关的miRNA还包括miR372, miR373, miR125等[31,32]。但是对于这些通过芯片筛选得到的miRNA或者是新近研究发现的可能与衰老有关的miRNA究竟是如何通过p53通路来最终起到调控细胞周期, 并由此改变细胞衰老、凋亡的过程还未得到完全的阐明。

3 miRNA和视网膜母细胞瘤（Rb）肿瘤抑制通路

诱导细胞衰老的途径, 除了P53信号通路之外,另一条较为重要的信号通路是p16INK4A-Rb通路[33]。近几年, 也有一些学者开始对 miRNA如何影响该通路进行了研究。

来自美国的Martinez研究组相继报道了一些在Rb诱导产生的衰老过程中存在差异表达的miRNA。该小组在 HeLa宫颈癌细胞中发现, 在细胞衰老的既定模式中, miRNA的表达可以抑制人类乳头状瘤病毒癌基因 E7, 从而快速抑制 Rb依赖的衰老。在他们的研究中发现, 在 Rb依赖并且诱导的衰老过程中共25个miRNA上调, 24个miRNA下调[34-36]。miR29和 miR30家族属于在衰老过程中上调的miRNA, 而且这一上调过程需要 Rb通路的激活。2010年, 该小组在进一步研究中提出, 对miR29和miR30表达进行干扰可以抑制衰老。miR29和miR30通过结合至B-Myb mRNA（也被称为MYBL2, 可以编码转录因子从而影响细胞周期）的3'UTR来调节该蛋白表达, 在 Rb驱动的细胞衰老过程中发挥重要作用[37]。

Noonan等[38]证实 miR499a在人类前列腺癌细胞中下调, 而它所介导的前列腺癌细胞的生长停滞正是依赖Rb蛋白。同时该小组对3'UTR区域进行了分析, 确定了细胞周期蛋白 D1（CCND1）是miR499a的直接的下游标靶, 从而证实 miR499a是Rb通路的一个重要的miRNA组成成员。

但是关于miRNA和Rb通路的研究目前还不是很多, 虽然已经找到了一些明确的标靶蛋白, 但是今后还需对 miRNA如何通过该通路进行衰老的调控进行更深入的研究, 方能阐明整个真相。

4 miRNA和一些特殊途径

迄今为止, 很多研究都集中于探讨miRNA通过降低mRNA的稳定性和（或）影响翻译过程从而调控mRNA的表达, 最终控制不同的细胞衰老过程。但是在miRNA合成过程中也有一些重要的酶参与其中,例如Dicer和核糖核酸酶内切酶Ⅲ。通过这些酶的调节同样也可以调控miRNA从而影响衰老。

Damiani等[39]在小鼠的视网膜上敲除Dicer后,发现部分miRNA水平下降, 而且很快产生了视网膜的退行性病变, 证实了miRNA与这些退行性疾病有密切关联。同样, Sand等[40]在人类皮肤癌细胞中也证实了Dicer和Drosha的表达失调, 从而影响了miRNA水平。而Srikantan等[41]更进一步提出, 这两个主要酶Dicer和Drosha不仅影响miRNA的合成水平, 同时也能影响生物整体的翻译过程, Dicer水平的下降可以显著增强细胞的衰老, 但是Drosha的下降却对衰老没有影响。这一发现提示, 在翻译过程中Drosha/Dicer效应可能是引起衰老的独立因素,并进一步证明了miRNA可以直接或间接地增强mRNA的翻译[41]。

Das等[42]则发现人类多核苷酸磷酸化酶[human polynucleotide hosphorylase, hPNPase（old- 35）]是一种进化保守的RNA加工酶, 能够在调节细胞生理作用中起放大作用。hPNPase可能正是通过特定的mRNA或小分子非编码的miRNA对基因表达进行调控。因此, 有针对性地对hPNPase的过度表达进行调控, 可以选择性下调RNA的表达, 从而参与整个病理生理过程。

诸如此类的报道尚不多见, 而且仅仅局限于少数的几个器官细胞中, 是否在所有的衰老脏器中均存在这样的酶合成异常, 值得我们进行下一步的探讨。

综上所述, 我们对 miRNA的研究正在逐步走向更深的层次, 我们已经认识到, 一个miRNA可以调控多个下游靶标, 而这些标靶蛋白中有不少都参与了细胞周期的调控, 从而在整个衰老体系中发挥或多或少的作用。但是, 限于整个调控网络的复杂性、我们对于整个网络的构成始终是处于初窥门径、略知一二的状态, 但这同样也给了我们广阔的空间可以继续研究。不可否认, 这些非编码的小分子RNA在人类的生命旅程中扮演着相当重要的角色,我们如果能对 miRNA与细胞发育生长调控机制之间的联系阐述得更加具体, 不仅仅局限于某几个脏器或肿瘤细胞, 可以在整个机体的任何一个脏器,甚至于动物模型中将这些机制复制出来, 那么我们才算真正地对miRNA的机制了然于胸, 豁然贯通。只有搞明白了这些错综复杂的关系, 我们才有机会可以调控细胞生命过程中的多个分子, 到那时, 人类长生不老的美梦才会有可能实现。

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