仙灵骨葆对去势大鼠腰椎软骨终板退变的预防作用

张胜强，孙倩

（河北省唐山市唐海县医院骨二科，河北 唐山 063299）

仙灵骨葆对去势大鼠腰椎软骨终板退变的预防作用

张胜强，孙倩

（河北省唐山市唐海县医院骨二科，河北 唐山 063299）

目的 探讨仙灵骨葆预防去势大鼠腰椎软骨终板退变的作用机制。方法 30只3月龄Sprague-Dawley（SD）大鼠，随机均分为3组，每组10只：双侧卵巢切除（OVX）手术组；手术对照组（Sham组）；双侧卵巢切除+仙灵骨葆组（OVX+XLGB组），3组术后三个月处死，常规组织切片，HE常规染色、番红0-固绿特殊染色测量软骨终板血管芽相对面积及运用免疫组化检测软骨终板MMP-13的表达。结果 OVX组大鼠椎间盘MMP-13表达及软骨终板血管芽相对面积减少显著高于Sham组和OVX+XLGB组（P<0.05）；Sham组显著低于OVX+XLGB组（P<0.05）。结论 仙灵骨葆可能通过降低软骨内MMP-3表达量、增加终板血管芽相对面积，延缓椎间盘的退变.

卵巢切除；软骨终板退变；免疫组化；仙灵骨葆

研究证实，软骨终板在椎间盘退变的病理过程中最早出现退变，血管芽面积和椎间盘退变密切相关[1]。仙灵骨葆由淫羊藿、续断、补骨脂、知母、丹参等组成的补肾壮骨药物，主要用于骨质疏松的治疗。目前，国内外尚无有关XLGB对软骨终板退化及退化过程中表达的相关因子影响的报道，因此本实验通过OVX大鼠建立骨质疏松（OP）模型，并通过对椎体和椎间盘软骨终板组织学、形态学及相关因子表达的研究，探讨XLGB对椎间盘退变的预防作用机制，为临床治疗提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 动物模型的建立和实验方案

健康3月龄雌性Sprague-Dawley大鼠30只，体重220±28 g（河北联合大学实验动物中心，Ⅱ级）随机分为3组，每组10只：双侧卵巢切除组（OVX组）；单纯手术对照组（Sham组）；双侧卵巢切除+仙灵骨葆治疗组（OVX+XLGB组）。利用10 ml/L戊巴比妥钠（40 mg/Kg）腹腔注射麻醉，在无菌条件下20只大鼠行背部入路双侧卵巢切除手术，10只大鼠暴露卵巢但不切除．仙灵骨葆治疗组（XLGB组）术后第二天仙灵骨葆灌胃（270 mg/kg/d），Sham组和卵巢切除组（OVX组）大鼠按以上方法皮下注射生理盐水。3个月后处死大鼠取 L4-L5椎体及椎间盘置于10%福尔马林中性缓冲液中准备HE常规染色、特殊染色及免疫组化。

1.2 免疫组化步骤

石蜡切片60℃烤箱烘烤20 min，常规脱蜡至水。PBS液漂洗3次，每次3 min。复合酶在室温下对组织抗原修复15 min。每张切片滴加3%H2O2室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min。除去PBS，滴加一抗（1：100，室温下孵育 60 min 或者 4℃过夜。PBS冲洗3次，每次5 min。除去PBS后每张切片滴加50 ul酶二抗聚合物，室温下孵育40 min或者4℃过夜。PBS冲洗3次，每次3 min。除去PBS液，每张切片滴加50 ul新鲜配置的DAB溶液，显微镜下观察，适时终止自来水冲洗3 h，苏木素复染min，0.5%盐酸酒精分化10 s，自来水冲洗30 min，PBS返蓝。切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。阴性对照用PBS代替Ⅰ抗。利用半定量方法测定灰度值。

1.3 番红O-固绿染色

石蜡切片烘烤后常规脱蜡至水，入苏木素染液5 min，自来水冲洗，0.5%盐酸酒精液经10 s分色，氨水中返蓝，自来水冲洗3 min。入0.02%固绿溶液3 min。0.1%醋酸洗片，入0.1%的番红染液30 min。切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4 椎体软骨终板血管芽相对面积测量

取HE染色切片，用德国Leika显微镜观察软骨终板下血管形态和数目，在HEX 100的显微镜下分别计数4个事业并取平均值，结果以x±s表示。

1.5 统计方法

各组大鼠所有参数均以均数±标准差表示（x±s）。资料用 SPSS（V11．0）来分析，利用 Student’s t检验来比较各组之间的显著性差异。P<0.05被认为有显著性差异。

2 结果

2.1 组织学表现

Sham组大鼠椎间盘骺板和关节软骨终板软骨细胞排列规则，血管芽丰富。OVX组大鼠椎间盘骺板和软骨终板变薄，软骨细胞数量减少，排列紊乱，在靠近次级骨化中心的软骨终板和骺板钙化，甚至完全骨化，软骨终板和髓核之间的过渡区（transitional zone）被许多小软骨细胞所取代。髓核脊索细胞数量进一步下降，出现大量团块状的软骨样细胞，髓核粘液变、裂隙生成。纤维环后部结构排列紊乱，厚度变薄，间隙增宽。血管芽数目减少，腔隙较小，周围钙化．XLGB组大鼠椎间盘髓核内脊索细胞及血管芽数目较Sham组大鼠下降，但明显多于OVX组的大鼠，软骨终板的钙化和后部纤维环的紊乱程度较OVX组大鼠也明显减轻。（见图1、表1）

表1 各组软骨终板血管芽相对面积（x±s）

2.2 免疫组织化学结果

2.2.1 光镜下观察结果：MMP-13蛋白的表达在胞浆，呈棕黄色颗粒状，OVX组的表达明显高于SHAM组和OVX+XLGB组，OVX+XLGB组的表达高于SHAM组.（见图2、表2）

图1 软骨终板（番红O-固绿染色×10）

图2 MMP-13的表达（SP法ⅹ10）

表2 各组MMP-13灰度值比较

注：△P<0.05，vs Sham 组，*P<0.05，vs OVX 组

3 讨 论

椎间盘是一个无血管组织，营养主要通过软骨终板及纤维环两个途径被动扩散而来，软骨终板途径是主要途径，Hassler[2]发现随着退变的加重，终板血管芽发生改变，导致椎间盘营养障碍。本研究发现，OVX组大鼠腰椎间盘发生严重退变，表现在椎间盘髓核脊索细胞数量减少，出现软骨样细胞，髓核粘液变、裂隙生成，软骨终板变薄，软骨细胞数量减少、钙化，甚至完全骨化，纤维环后部结构排列紊乱，厚度变薄，间隙增宽，椎体边缘骨赘增生，血管芽分布不均，管壁粗糙不平。XLGB组大鼠也呈现一定程度的椎间盘退变，但程度明显减轻。这表明仙灵骨葆有助于延缓腰椎间盘退变。

MMP-13主要来源于软骨细胞，主要降解Ⅱ型胶原。MMP-13对Ⅱ型胶原的催化效率大概是MMP-1对Ⅱ型胶原催化效率的5倍，是椎间盘退变的重要因子。研究证实[3、4]椎间盘退变模型中，MMP-13表达水平有明显的增加。本实验结果表明：OVX大鼠软骨终板中MMP-13的蛋白表达较其他组明显增高，证实了MMP-13在椎间盘退变作用中的作用。

仙灵骨葆由淫羊藿、续断、补骨脂、知母、丹参等组成的补肾壮骨药物，淫羊藿可以促进成骨细胞的分化及矿化功能，诱导破骨细胞凋亡，抑制骨吸收，并促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化[5]，用于骨质疏松的治疗。丹参有活血通络，养血止痛的作用，可以改善微循环和血流速度，减轻血管内炎症细胞的渗出，研究证实[6]仙灵骨葆有增加雌激素的作用，雌激素可以抑制IL-1b、TFN-a等负向炎症介质的表达，IL-1是MMP-13的有效诱导剂，IL-1使处理过的椎间盘细胞中MMP-13的基因表达增强，Ⅱ型胶原基因表达下降[7.8]，仙灵骨葆可能通过抑制IL-1的表达抑制MMP-13的表达，但具体的信号途径还有待进一步研究。

[1] 郝定均，何立民，袁福镛，等.脊髓损伤患者后期并发症及相关因素探讨[J]. 中国脊柱脊髓杂志，2005，15（5）：267-270.

[2] Hassler O.The human intervertebal disc；a microan-giographical study on the vascular supply of vaious ages[J].Acte Orthop Scand，1970，40：765-781.

[3]Thorsten Guehring，Georg W Omlor，Helga Lonrenz，et al.Stimulation of gene expression and loss of anular architecture caused by experimental disc degeneration-an in vivo animal study[J].Spine，2005，30：2510-2515.

[4] Le Maitre CL，Freemont AJ，Hoyland JA.The role of interleukin-1 in the pathogenesis of human intervertebral disc degeneration.Arthritis[J].Res Ther，2005：732-745.

[5] 殷晓雪，陈仲强，党耕町，等.淫羊藿苷对人成骨细胞增值与分化的影响[J]. 中国中药杂志，2005，30（4）：289.

[6] 崔省珍，呼亚玲.仙灵骨葆胶囊对去卵巢大鼠骨代谢生化指标的影响[J]. 临床医学实践杂志，2007，16（4）260-262.

[7] Tsai TT，Guttapalli A，Oguz E，et al.Fibroblast growth factor-2 maintains the differentiation potential of nucleus pulposus cells in vitro：implications for cell-based transplantation therapy[J].Spine，2007，32（5）：495-502.

[8] Singh K，Masuda K，Thonar EJ，et al.Age-related changes in the extracellular matrix of nucleus pulposus and anulus fibrosus of human intervertebral disc[J].Spine，2009，34（1）：10-16.

Treatment with Xianglinggubao（XLGB） suppresses lumbar intervertebral cartilage endplate in ovari ectomized rats

ZhANG sheng-qiang，SUN Qian
（Department of Orthopedics，The Tan Hai Hospital of Tangshan Hebei 063200，China）

ObjectiveTo investigated the effects of Xianglinggubao on vertebral cartilage endplate degeneration in the OVX rats．MethodsThirty 3-month-old female Sprague-Dawley rats were randomized into three groups of ten animals each：Sham group；Xianglinggubao group；OVX group all rats were killed 3 months after surgery．HE、safranin O-fast green and immuno stained were used to evaluate the relative area of vascular buds and MMP-13 in the cartilage endplate.ResultsThe immunostained expression of MMP-13 and the relative area of vascular buds in the OVX group was higher than that in Sham group and OVX+XLGBgroup（P<0.05），the Sham group was lower than the OVX+XLGBgroup（P<0.05）。ConclusionXLGB probably protects articular cartilage by decreasing the expression levels of MMP-13 and increasing the relative area of vascular buds.

ovariectomy；cartilage endplate degeneration；immunohistochemistry；Xianglinggubao

R713.6；R687.3

A

1005-7324（2012）06-0422-03

2012-05-21；修访日期：2012-06-13

河北省唐山市科技创新项目（ 111302046a）

张胜强（1974-），男，河北籍，副主任医师，硕士

研究方向：骨质疏松与骨关节炎，

电 话：13933324066

电子信箱：zsq741105@163.com

·临床研究·