1株产纤维素酶木霉菌种的鉴定

桓明辉，李杨，刘晓辉，邓春海，高晓梅，敖静，王平

(1.辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000;2.沈阳农业大学，辽宁沈阳110036)

纤维素是绿色植物细胞壁的主要成分，是地球上最丰富的有机物质，也是一类取之不尽，用之不竭的可再生能源。每年由于工业、农业生产可产生大量的纤维素废弃物，如农作物秸秆、锯木渣、植物农药残渣和生活垃圾等。如何有效利用这些废弃物，对解决环境污染及实现生物资源可持续性发展具有重大意义。目前，纤维素废弃物主要是通过物理、化学、生物或者三者联合的处理方法，使这些物质可以用于生产燃料、有机肥、饲料添加物和化工原料等。因而纤维素作为一种可再生能源，它的开发和利用越来越受到人们的广泛关注。木霉菌具有较强的分解纤维素能力，通过分泌胞外氧化酶来降解木素，这种木素降解酶系的主要成分有纤维素酶、半纤维素酶和β-葡萄糖苷酶等。由于它在降解木素、微生物菌体形态形成以及植物病原等方面的功用，使之在制浆造纸工业、染发工艺、饮料加工工艺等方面得到了重要的研究和应用。尤其在制浆造纸工业的纸浆生物漂白、废水处理等方面具有很大的研究价值和应用潜力。本文主要通过形态及分子手段对本实验室自行筛选的1株木霉菌种F-01-6进行分类鉴定，为对该菌的进一步研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株本实验室自行筛选的木霉菌种F-01-6。

1.1.2 培养基PDA培养基:土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂16 g，加水至1 L;MEA培养基:麦芽糖12.5 g，琼脂16 g，加水至1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌株形态观察将保存菌株接种到PDA培养基平皿上，置于28℃培养72 h，观察并记录菌落特征和菌株形态特征。

1.2.2 菌丝培养及基因组DNA的提取将低温保藏的木霉菌菌种转接到PDA斜面上，25℃下培养。7 d后接入100 mL PDA液体培养基中，28℃下100 r/min振荡培养4 d，收集菌丝，TE缓冲液洗涤后放入-20℃冰箱保藏备用。用本实验室提取链霉菌基因组DNA的方法略加改动，DNA提取物于-4℃冰箱贮藏备用。

1.2.3 基因间隔序列(ITS)基因PCR扩增引物:试验采用引物为通用引物，由大连宝生物合成。具体序列为ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR反应体系(25 μL):10×缓冲液2.5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL，引物各1 μL，Taq酶(83.35 mol/L)0.50 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 18.25 μL。PCR反应条件:95℃变性5 min;95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环:72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 PCR产物回收及测序采用低熔点琼脂糖电泳切胶回收产物。PCR产物回收后，以PCR引物为测序引物，分别从正反链双向测序，由大连宝生物公司完成。

1.2.5 序列分析测序结果在GenBank中进行比对。将测得的序列与用Blast软件从GenBank搜索到的相关序列，用CLUSTAL X［4-5］软件进行对位排列后再进行手工校正。构建ITS系统发育树。系统发育树分析采用软件MEGA4中的邻近相邻法进行，利用bootstrap(1 000次重复)检验各分支的置信度。序列间进化距离根据Kimura-2参数遗传距离模型用分子进化遗传分析软件(MEGA)计算。

2 结果与分析

2.1 菌株形态特征及显微观察

菌落在MEA培养基表面蔓延迅速，初期无色至浅黄色，后绿色;分生孢子梗分枝与绿色木霉形态相似，但其孢子壁光滑。瓶梗单生、对生或3～5个轮生，7.3～12 μm×2.5～3.3 μm;分生孢子壁光滑，短圆柱形，形状规则，基部平截，3.0～5.6 μm×2.0～3.4 μm(图1)。

图1 F-01-6形态图片Fig.1 F-01-6 Merphological picture

2.2 菌株的分子鉴定

2.2.1 菌株的rDNA ITS区PCR扩增及测序2菌株的rDNA ITS区(含5.8 S区)PCR扩增电泳结果显示的条带特异、效果好。采用低熔点琼脂糖法进行切胶纯化回收并测序。菌株F-01-6 rDNA ITS区段总长度为556 bp。

2.2.2 序列分析结果将所测菌株的ITS区序列在GenBank核酸序列数据库中进行Blast搜索，得到同源性较高的同属不同种的ITS序列(表1)，在Blast搜索的结果中，发现200个菌种与F-01-6同源性都为99%，其中有4株菌与其同源性为100%。下载GenBank中同源性较高菌株的ITS序列与本实验所测的菌株ITS序列共同进行了比对，利用C1ustal X软件将序列匹配排列后，利用MEGA4.1软件采用邻近相邻法构建系统发育树，结果见图4。

图4 系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree

在Blast结果中可以看出，本菌株(SYS4993)的ITS区序列与Trichoderma longibrachiatum(长梗木霉)、Hypocrea pseudokoningii(拟康宁木霉)、Trichoderma koningii(康宁木霉)等的ITS区序列同源性均为99%。序列相似性大于95%且小于99%，鉴别为相同属;序列相似性小于95%，鉴别为同科。从系统发育树中可以看出，需要鉴定的菌株F-01-6(SYS4993)与EU935218(Trichoderma koningii)的置信度为92，遗传距离最近，结合菌体的形态学特征及子实体形态可以确定F-01-6为Trichoderma koningii。

表1 从GenBank中下载的同源性较高菌株Table 1 Higher homologous strains DownLoaded from GenBank

3 讨论

本实验通过形态学及分子生物学鉴定，确定此株产纤维素酶的木霉为Trichoderma koningii。

传统的真菌分类主要是根据子实体外观形态或微观的形态结构特征，但表型特征受环境影响较大，这就使得在不同环境条件下生长的同一种真菌经常表现出较大的形态差异，给分类和鉴定带来困难，真核生物编码核糖体核酸的基因是一个串联的重复转录单位，即18S rRNA-ITSI-5.8S rRNA-ITSII-28S rRNA，约100～200拷贝，包括编码区和非编码区，分隔编码区18、5.8、28S rDNA亚单位ITS为非编码区，编码区序列相对保守，而核糖体rDNA ITS序列变异较快。可提供较丰富的变异位点和信息位点。因此可作为一种分子标记用于属和种水平上的系统进化分析。近年来，这方面的文章很多，如利用ITS序列研究冬虫夏草和香菇的系统发育。由于ITS序列具有方便、快速的特点，因此也用于鉴定一些未知植株，如利用ITS序列对松茸和松乳菇的组织分离物进行的鉴定，所以rDNA ITS序列具有菌种分类鉴定的意义。

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