IL－23在鼻息肉中的表达及其意义

丁国臣，王亚辉，司 迎，王 艳，曹志伟

IL－23在鼻息肉中的表达及其意义

丁国臣1，王亚辉1，司 迎2，王 艳1，曹志伟3

目的检测IL－23在鼻息肉(nasal polyp，NP)组织中的表达，探讨其在鼻息肉发病中的作用。方法收集15例鼻息肉标本(NP组)和15例在鼻中隔偏曲矫正手术中根据需要部分切除下鼻甲黏膜组织(对照组)，分别采用免疫组织化学方法和RT－PCR方法检测两组IL－23蛋白和IL－23p19mRNA表达水平。结果NP组IL－23蛋白阳性表达炎性浸润细胞数明显多于对照组，单位目标面积光密度均值(0.321±0.023)明显高于对照组(0.199±0.011)，差异有统计学意义(P＜0.01);IL －23p19mRNA 表达水平 (0.676±0.077)明显高于对照组(0.212±0.015)，差异有统计学意义(P ＜0.01)。结论IL－23可能在参与了NP发病过程。

白细胞介素23;鼻息肉;免疫组化;逆转录聚合酶链反应

R765.22

鼻息肉(nasal polyp，NP)作为上气道黏膜慢性炎性反应的一部分，其发病机制与过敏性鼻炎、哮喘等极为相似，被公认为是“同一气道，同一疾病”［1］。研究发现，IL－23/IL－17轴更能科学地阐明慢性炎性反应性疾病的发病机制［2，3］。该学说认为，由炎性反应细胞产生的IL－23刺激Th0细胞，向一种新的Th细胞亚型－Th17细胞分化，Th17细胞产生炎性反应性细胞因子IL－17，后者具有强烈的致炎作用，从而导致多种炎性反应的发生。本研究于2010－06至2010－12通过检测IL－23在NP中的表达，探讨IL－23在NP发病中的作用，以期为IL－23/IL－17轴在鼻息肉中的作用机制提供理论依据，并为重新认识NP的发病过程和制订治疗策略提供参考。

1 对象与方法

1.1 对象 选取我院鼻息肉手术患者的鼻息肉组织(NP组)15例，男9例，女6例，年龄20～55岁，平均(39.50±3.21)岁;选取同期接受鼻中隔偏曲矫正术，且根据病情需要部分切除下鼻甲黏膜组织的患者15例作为对照组，男7例，女8例，年龄21～49岁，平均(35.70±2.95)岁。两组患者术前严格进行过敏性疾病问卷调查，均无多发性喷嚏、流水样鼻涕，或发作性喘息等过敏性疾病史，术前4周内均未接受过类固醇激素、抗组织胺类药物治疗及免疫治疗。

1.2 标本处理 标本取材后平分为两份，一份立即浸泡于10%中性甲醛固定液中固定，另一份立即投入液氮中冷冻保存。

1.3 主要试剂 兔抗人IL－23抗体(产品编号:bs－1193R)、SP试剂盒(通用型)、DAB显色试剂盒均由北京博奥森生物科技有限公司提供。总RNA提取试剂(Trizol)由invitrogen公司提供，cDNA第一链合成试剂盒、Taq酶、DL2000 DNA marker由北京康为世纪生物科技有限公司提供。引物由北京三博远志生物科技有限公司合成。

1.4 免疫组织化学方法 采用SP法，染色步骤按照试剂盒说明书进行。以PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色，光镜下观察阳性细胞。在清晰的背景上出现特异性棕黄色颗粒者为阳性，阴性对照无特异性着色。

灰度值测定:切片染色后，选择染色良好区域，应用Leica Q550CW图像采集和分析系统，每份标本选择3张染色较好切片进行观察，每张切片在显微镜下(40×10)选取5个互不重叠视野，测定单位面积阳性细胞表达的平均光密度值作为其表达情况，取均值作为该份标本IL－23蛋白的表达水平。

1.5 RT－PCR 用Trizol一步法提取总RNA。取1 μg总RNA用M－MLV反转录酶将其反转录为cDNA。IL－23p19mRNA的上游引物:(s)上游引物为:5'－ GAGCAGCAACCCTGAGTCCCTA －3'，下游引物为:5'－CAAATTTCCCTTCCCATCTAATAA －3'，扩增片段长度为230 bp。内参基因GAPDH上游引物:5'－TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGG －3'，下游引物:5'－CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC－3'，扩增片段长度为287 bp。扩增条件为94℃预变性2 min，94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环;进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后取出凝胶，在波长为254 nm的紫外灯下观察，并在凝胶成像系统中拍照、保存，计算平均光密度比值。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0软件，计量资料以±s表示，采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 IL－23p19mRNA表达水平 RT－PCR检测显示，NP组 IL－23p19mRNA相对表达水平为(0.676 ± 0.077)，明显高于对照组 (0.220 ±0.015)，两组差异有统计学意义(P ＜0.01)。

2.2 IL－23蛋白表达水平 对照组鼻黏膜中几乎没有IL－23阳性细胞存在(图1A)，NP组鼻息肉组织中可见大量IL－23阳性的炎性细胞浸润(图1B)。NP组IL－23蛋白相对表达水平(0.821±0.023)明显高于对照组(0.199 ±0.011)，两组差异有统计学意义(P＜0.01)。

图1 人鼻息肉中IL－23的阳性表达(SP×400)

3 讨 论

目前，NP确切的发病机制仍然不清楚，被公认为是一种多致病因素参与的疾病实体，这些因素包括鼻腔鼻窦解剖结构异常、感染与非感染性炎性反应、免疫异常、遗传因素等。关于NP发病过程，有多种学说解释，包括自主神经功能失调、离子通透性改变、气流动力学说、感染学说和变态反应学说等。随着分子生物学研究领域的进展，变态反应(allergic reaction，AR)及感染导致的炎性反应学说越来越受到重视。白细胞介素作为细胞因子在鼻息肉发病中也发挥了重要作用，如 IL －1、3、4、5、6、8 等［4，5］。

IL－23是2000年发现的白细胞介素12家族成员，其主要结构由p19和p40两个亚单位组成，其中，p40与IL－12中的p40具有同源性，人和小鼠活化的树突细胞(DC)、巨噬细胞(Mφ)、T细胞和内皮细胞都能产生IL－23，但最主要由活化的DC产生［6］。IL－23的主要生物学功能是调解新的CD4+T细胞亚群(Th17细胞)产生IL－17，形成IL－23/IL－17轴而在自身免疫疾病、慢性炎性反应性疾病中发挥重要作用［7－10］。IL－23通过此途径与多种自身免疫性炎性反应性疾病有关，并在局部组织重塑过程中起要作用，如自身免疫性脑脊髓膜炎、类风湿关节炎、牛皮癣、支气管哮喘等［11－13］。IL －23 在过敏性鼻炎鼻黏膜中存在高表达［14］，但在NP中的表达状态还不清楚。

本研究结果表明，IL－23在NP中表达明显增高，说明IL－23可能参与了NP的发病过程，但其具体机制尚不清楚。深入研究NP中IL－23与其他白细胞介素家族成员的作用机制，将为认识NP发病机制提供一条新的途径，同时，针对IL－23的治疗，可能会成为治疗NP的一个新靶点。

［1］姜晓丹，李 琳，朱冬冬.2010年同一气道 同一疾病国际论坛纪要［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2010，45(12):1049 －1050.

［2］IVANOV S，BOZINOVSKI S，BOSSIOS A，et al.Functional relevance of the IL－23/IL－17 axis in lnugs invivo［J］.Am J Resoir Cell Mol Biol，2007，36(4):442 －451.

［3］KIKLY K，LIU L，NA S，et al.The IL －23/Th(17)axis:therapeutic targets for autoimmrne inflammation ［J］.Curr Opin Immunol，2006，18(6):670 －675.

［4］Chen Y S，Arab S F，Westhofen M，et al.Expression of intedeukin－5，interleukin－8，and interleukiu－10 mRNA in the ostecmeatal complex in nasal polypnsis［J］.Am J Bhinol，2005，19(2):117 －123.

［5］Hamilos D L，Leung D Y，Huston D P，et al.GM －CSF，IL－5 and RANTES immunoreaetivity and mRNA expression in chronic hyperplastic sinusitis with nasal polyposis［J］.Clin Exp Allergy，1998，28(9):1145 －1152.

［6］OPPMANN B，LESLEY R B ，BLOM J C，et al.Novel p19 protein engages IL －12p40 to form a cytokine，IL －23，with biological activities similar as well as distinct from IL －12［J］.Immunity，2000，13:715 －725.

［7］Li J，Gran B，Zhang G X，et al.Differential expression and regulation of IL－23 and IL－12 subunits and receptors in adult mouse microglia［J］.J Neurol Sci，2003，215(1－2):95－103.

［8］Lubberts E，Koenders M I，Vanden W B.The role of T －cell interleukin－17 in comducting destructive arthritis:lessons from animal models ［J］.Arthritis Res Ther，2005，7(1):29 －37.

［9］Fuss I J，Becker C，Yang Z，et al.Both IL －12p70 and IL－23 are synthesizactive Crohn’s disease and are down－regulated by treatment with anti－IL－12p40 monoclonal antibody［J］.Inflamm Bowel Dis，2006，12(1):9－15.

［10］Yuan X，Hu J，Belladona M L，et al.Interleukin － 23 －expressing bone matrowderived neural stem－like cells exhibit antitumor activity against intracranial glioma［J］.Cancer Res，2006，66(5):2630 －2638.

［11］Dewald G，Bork K.Missense mutations in the coagulation factorⅫ(Hageman factor)gene in hereditary angioedema with mormal Cl inhibitor［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，343(4):1286 －1289

［12］Bernstein I L.Hereditary angioedema:a current state－of–the－art review，Ⅱ:historical perspective of nonhistamine－induced angioedema［J］.Ann Allergy Asthma Immunol，2008，100(1 Suppl 2):S2 － S6.

［13］Wakashin H，Hirose K.Maezawa Y，et al.IL － 23 and Thl7 cells enhance Th2－cell－ mediated eosinophilic airway inflammation in mice［J］.Am J Respir Crit Care Med，2008，178:1023 －1032.

［14］刘 阳，刘 争，崔永华，等.白细胞介素23在变应性鼻炎患者鼻黏膜中的表达及意义［J］.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2010，24(14):638 －640.

Expression of IL－23 in nasal polyps and its significance

DING Guochen1，WANG Yahui1，SI Ying2，WANG Yan1，and CAO Zhiwei3.1.Liaoning Provincial Corps Hospital;2.Liaoning Provincial Corps Department of Public Health，Chinese People’s Armed Police Forces，Shenyang110034，China;3.Department of Otorhinolaryngology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China

ObjectiveTo investigate the expression and role of interleukin－23(IL－23)in nasal polyp patients.Methods NP tissues of 15 nasal polyp(NP)patients and 15 simple deviations of normal inferior turbinate tissues of nasal septum patients were collected.mRNA and protein expression of IL－23 were detected by means of immunohistochemistry and RT－PCR.Results Immunohistochemistry staining demonstrated that there were far more IL－23 positive cells in NP patients than in normal controls.The average expression level of IL －23 protein in NP tissues(0.321 ±0.023)was significantly different(P ＜0.01)from that of normal inferior turbinate tissues(0.199±0.011).RT －PCR demonstrated that the average expression level of IL －23p19mRNA in NP tissues(0.676 ±0.077)was significantly different(P ＜0.01)from that in normal inferior turbinate tissues(0.212 ±0.015).Conclusions IL－23 may be involved in the chronic inflammation of NP.

interleukin－23;nasal polyp;immunohistochemistry;RT－PCR

丁国臣，男，1977年出生。硕士，主治医师。主要从事耳鼻喉科临床工作。

1.110034 沈阳，武警辽宁总队医院耳鼻喉科，2.110034沈阳，武警辽宁总队卫生处;3.110004 沈阳，中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科

(2012－01－06收稿 2012－07－19修回)

(责任编辑 尤伟杰)