HPLC法同时测定二妙丸中黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的含量

潘 超，张 莉，王 玉，2

(1.中国药科大学，江苏 南京 210009;2.江苏省食品药品检验所，江苏 南京 210008;3.南京大学 环境学院，江苏 南京 210008)

二妙丸是中医用于燥湿清热的基础名方，由苍术和黄柏两味药组成，用于治疗湿热下注，足膝红肿热痛，下肢丹毒，白带，阴囊湿痒等病症［1］。目前国内约有数十家制药企业生产该品种。收载于《中国药典》(2010年版一部)［2］的二妙丸质量标准中只对盐酸小檗碱用薄层色谱扫描法进行了含量测定。由于黄连及小檗属多种植物中均含盐酸小檗碱，仅控制盐酸小檗碱含量不能真实反映二妙丸的质量。

药材黄柏的主要活性部位含多种生物碱类成分，主要有黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱等，采用高效液相色谱(HPLC)法分别测定黄柏中部分生物碱含量已见报道［3-6］，但未见同时测定的报道。本文采用HPLC法同时测定二妙丸中上述5种生物碱成分的含量，并测定了不同厂家不同批次二妙丸中的生物碱含量，为更有效的控制二妙丸的质量提供参考依据。

1 仪器与试药

LC-10ADVP液相色谱仪、SPD-10AVP检测器、SIL-HTA自动进样器、CTO-10ASVP柱温箱、LC Solution工作站，日本岛津公司;TGL-16G台式高速离心机，上海医疗器械有限公司手术器械厂。

盐酸巴马汀(110732-200907)和盐酸小檗碱(110713-200911)，中国药品生物制品检定所;黄柏碱(RFS-H-100718-03)，成都瑞芬思生物科技有限公司;木兰花碱(09-2123)和药根碱，南京泽朗医药科技有限公司。黄柏碱、木兰花碱和药根碱经HPLC面积归一化法计算，含量分别为99.39%，98.60%和98.69%。

二妙丸，吉林紫鑫药业股份有限公司(批号:A、B、C)和山东方健制药有限公司(批号:D、E、F)提供。

乙腈、三乙胺为色谱纯;其它试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:phenomenex Luna C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相 A:乙腈，流动相 B:0.02 mol/L磷酸二氢钾-0.2%三乙胺(磷酸调pH 3.0)，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1;流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，检测波长为284 nm;进样量:10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Program of Gradient Elution

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀适量，精密称定，加甲醇溶解并制成浓度分别为802，206，101，150 μg/mL 的混合对照品溶液(S1);取盐酸小檗碱适量，精密称定，加甲醇溶解并制成浓度为1 015 μg/mL的对照品溶液(S2)，精密吸取S1和S2适量，加甲醇制成黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱浓度分别为 16.04，4.12，2.02，3.00 和 10.15 μg/mL 的混合对照品溶液(S3)，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品内容物，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相A-流动相B(12:88)50 mL，密塞，称重，水浴回流0.5 h，放冷，称重，加流动相补足重量，摇匀，10 000 r/min离心 10 min，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按2.2.2项下方法制备缺黄柏的阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

5种生物碱色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数按各生物碱峰计均大于7 000，说明5种生物碱在此色谱条件下均得到较好的分离，且峰形对称。

2.4 专属性试验

取S3、样品溶液、阴性对照溶液按2.1项下色谱条件测定，HPLC图见图1，结果表明，阴性对照溶液在5种生物碱出峰位置处无干扰。

图1 专属性试验的HPLC图Fig.1 HPLC Chromatograms of specificity test

2.5 线性关系考察

精密吸取 S1 0.05，0.1，0.2，0.3，0.5，1.0，1.5和2.0 mL分别置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列浓度的对照品混合溶液;精密吸取S2 0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.5 和 5.0 mL 分别置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列浓度的盐酸小檗碱对照品溶液。分别精密吸取10 μL，按2.1项色谱条件依次进行测定，以浓度(X，μg/mL)为横坐标，色谱峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程分别为:黄柏碱Y=9 203 X-697，r=0.999 9，线性范围为3.99 ～159.40 μg/mL;木兰花碱Y=11 628 X-5 077，r=0.999 4，线性范围为1.01～40.52 μg/mL;药根碱 Y=30 468 X-798，r=0.999 9，线性范围为 0.50 ～20.00 μg/mL;盐酸巴马汀Y=35 338 X-608，r=0.999 9，线性范围为0.65～25.81μg/mL;盐酸小檗碱Y=29 818 X+46 505，r=0.999 9，线性范围为 8.81 ～440.51 μg/mL。

2.6 精密度试验

精密吸取S3，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，计算各组分峰面积的RSD，结果黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的RSD分别为0.85%，0.28%，0.30%，0.25%和0.11%。

2.7 稳定性试验

取供试品(批号:F)按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，精密吸取供试品溶液 10 μL，分别在 0，2，4，6，8，10，12，14，16，20 和 24 h各进样一次，测定峰面积，计算各组分峰面积的RSD，结果黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的RSD分别为1.18%，1.33%，1.88%，1.44%和0.08%。5种生物碱在24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

取供试品(批号:F)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，平行测定6次，结果黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的平均含量分别为 2.02，0.74，0.23，0.29和13.62 mg/g;RSD分别为1.24%，1.86%，1.34%，1.05%和1.89%。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品6份，各0.25 g，精密称定，分别精密加入一定量的5种生物碱的对照品溶液，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表2。黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的平均回收率分别为98.09%，98.04%，99.75%，102.74%和104.84%;RSD分别为1.04%，1.36%，0.14%，1.83%和0.62%。

2.10 样品含量测定

按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，分别测定两个厂家6批二妙丸中5种生物碱的含量，结果见表3。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests

表3 样品测定结果Tab.3 Contents of five alkaloids in samples

3 讨论

二妙丸黄柏药材的主要活性成分是生物碱类物质，其中盐酸小檗碱含量较高［7］，《中国药典》(2010年版一部)的二妙丸质量标准中只对盐酸小檗碱用薄层色谱扫描法进行了含量测定。然而，黄柏、黄连及其它非法定药材如三颗针(Radix Berberidis)、十大功劳(Folium Mahonicum)等，均富含盐酸小檗碱。故仅以盐酸小檗碱含量评价二妙丸质量，专属性有所欠缺。且黄柏碱是黄柏的特征性成分，黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀各自有其药理作用。故在对二妙丸进行质量控制时，除盐酸小檗碱外，应增加黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀的检测。

［1-6，8］，提取溶剂考察了盐酸-甲醇(1∶100)、醋酸-甲醇(1∶100)、甲醇、90% 甲醇、50%甲醇、10%甲醇、流动相A-流动相B(12∶88)，结果表明盐酸-甲醇(1∶100)、醋酸-甲醇(1∶100)的酸性太大，不适合提取黄柏碱和木兰花碱，90%甲醇和甲醇的极性偏小，亦不适合提取极性较大的黄柏碱和木兰花碱。通过比较其他3种提取溶剂对5种生物碱的提取率，流动相提取最完全。提取方法考察了加热回流提取法和超声提取法，通过比较不同提取溶剂体积、不同提取时间下两种提取方法对5种成分的提取率，最终确定为加流动相50 mL加热回流提取30 min。

在流动相的选择中，分别尝试了乙腈-0.5%三乙胺(磷酸调pH 2.5)、乙腈-0.2%三乙胺-0.2%磷酸、乙腈-0.052 mol/L磷酸二氢钾-0.2%三乙胺、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH 3.0)、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾-0.2%三乙胺(磷酸调pH 3.0)5种不同的流动相体系。最终确定采用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾-0.2%三乙胺(磷酸调pH 3.0)为流动相，此流动相体系使5种生物碱类成分得到有效分离，并且峰形对称。在测定波长考察中，以文献［9-10］报道的345 nm作为检测波长，发现此波长处药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱检测灵敏度高，但黄柏碱和木兰花碱的吸收很弱;以220 nm为检测波长时，黄柏碱有较强吸收，但其他4种生物碱的吸收变弱;而在284 nm波长处5种成分的检测灵敏度均较高，故选用284 nm为检测波长。

本实验对来自不同厂家不同批次的二妙丸中5种生物碱的含量同时进行了测定。结果发现不同厂家不同批次的二妙丸中5种生物碱类成分的含量差别较大，药材来源、制剂生产工艺等均可能影响制剂中生物碱的含量。以盐酸小檗碱、黄柏碱、木兰花碱、药根碱和盐酸巴马汀的含量同时控制二妙丸的质量，结果更加可靠。

参考文献:

［1］ 张蓓蕾，夏醒醒，陈 勤.HPLC测定二妙丸中盐酸小檗碱的含量［J］.中成药，2008，30(1):152-154.

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［3］ 范积平，张贞良，廖晓玲.不同产地黄柏药材中4种主要生物碱类成分的含量测定［J］.广东药学院学报，2010，26:54-57.

［4］ 张 杨，张振秋，王海波，等.二妙丸多指标化学成分质量研究［J］.中成药，2009，31(4):562-566.

［5］ 张 倩，蔡丽芬，钟国跃，等.RP-HPLC法同时测定关黄柏中小檗碱、药根碱、巴马汀及黄柏酮含量的方法学研究［J］.中国中药杂志，2010，35(16):2061-2064.

［6］ 王 瑾.RP-HPLC法测定黄柏中小檗碱、巴马汀和药根碱的含量［J］.药物分析杂志，2007，27(4):610-612.

［7］ 龚千锋.中药炮制学［M］.北京:中国中医药出版社，2003:220-221.

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［9］ 祝晨蔯，林朝展，莫建霞，等.HPLC法测定黄柏药材中小檗碱与黄柏碱的含量［J］.中药新药与 临床药理，2004，15(4):262-264.

［10］马蓉蓉，唐意红，马春辉，等.HPLC-UV同时测定不同产地黄柏中小檗碱和巴马汀的含量［J］.黑龙江医药，2007，20(6):560-562.