THADA，PDLIM5，SLC22A3和染色体17q24区多态性与中国北京人群前列腺癌的关联性研究

王 钢 焦海燕 杨 阔 徐 勇 杨一歌 霍正浩 杨 泽 王建业※

2宁夏医科大学医学遗传与细胞生物学教研室 750004

3天津医科大学第二附属医院 300211

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是世界老年男性最常见的肿瘤类型，预计在2011年美国男性癌症诊断超过24万新病例［1］。我国PCa患病率过去一直较低，近年来随着人口老龄化增加、生活水平及医疗诊断技术的提高，PCa患病率缓慢增长。以上海为例，前列腺癌每年新发病例数由1984～1989年的1.833人/10万人口上升至2005年的9.59人/10万人口［2］。PCa已位居我国男性泌尿、生殖系统恶性肿瘤发病率的第3位，成为影响我国45岁以上男性生活质量和预期寿命的重要疾病之一［3］。

北京的前列腺癌发病率类似于上海［4］。年龄、种族及地理因素等都是构成前列腺癌的风险因素［5］。然而，这些因素都可能无法完全解释前列腺癌发病率的不同人群之间的差异。因此，在特定的基因，包括8q24区域的活性基因控制，遗传变异，可以发挥对前列腺癌易感性的不确定性作用。2012年3月至2012年8月，我们对北京市居民中PCa患者和正常对照者 THADA(rs1465618)、PDLIM5(rs17021918)、SLC22A3(rs7679673)和染色体17q24区(rs1859962)进行关联分析，并分析PCa患者中基因型和表型(临床、遗传、膳食习惯、嗜好等)的关系。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象:PCa患者来自卫生部北京医院泌尿外科，共112例，年龄(50～85)岁，平均年龄74岁，PSA值为0.1 ～1000.0 ng/ml，平均 37.6 ng/ml，均经组织病理学检查确诊。对照组91例，筛选自本院体检中心的常规体检人群，均为男性，无PCa和其他肿瘤家族史，PSA值0～3.6ng/ml，平均1.4ng/ml，并经直肠指诊和B超等检查排除PCa，年龄(60～88)岁，平均年龄72岁，与 PCa组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。研究对象均签署知情同意书，研究程序经本院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂:全基因组DNA提取试剂盒购自博尔诚(北京)科技有限公司;Taq DNA聚合酶和dNTP购自北京鼎国生物技术有限公司;饱和荧光染料购自美国Idaho公司。引物由生工生物(上海)有限公司合成;基因测序由华大基因公司完成。

1.1.3 主要仪器:PCR扩增仪为美国MJ公司的PTC.225型PCR仪;高分辨熔解曲线(high resolution melting，HRM)基因突变/基因分型检测系统为美国Idaho公司的Lightscanner TMHR-I96;DNA定量分析仪为德国Eppendorf公司的Biophotometer蛋白/核酸比色仪。凝胶成像系统为美国Bio.Rad公司的Gel DOC-2000成像系统。离心机为美国Beckman公司的AllegraTM21R型离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取及定量:按试剂盒具体名称说明书进行操作。样本DNA置4℃保存。

1.2.2 PCR 反应:从 Gene bank 中查取 rs1465618，rs17021918，rs7679673和rs1859962附近的基因序列，引物设计通过Oligo6.0和Primer 5.0软件完成。

rs1465618上游引物5′-TCTGGTAGAGCTTGGTAAGTCC-3′，下游引物 5′-ATATTGTGAAGCCTTGGTG-3′，退火温度59℃;rs17021918 上游引物 5′-GCTGCTATTTTTCCTT-3′，下游引物 5′-TTACTAAGCAGGTGCTC-3′，退火温度 50℃;rs7679673 上游引物 5′-GCCAAGATTATAGGAA-3′，下游引物 5′-TCATGGGAAAATTCTAC-3′，退 火 温 度 50℃;rs1859962 上游引物 5′-AGACTTTTCCAAATCCCTG-3′，下游引物5′-GCCCCATTATTAGAAATCTTG-3′，退火温度 54℃;低温内参上游引物5′-TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAATATAATA-C3，下游引物 5′-TATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA-C3。高温内参上游引物 5′-GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGGGAAGCGGAGGGGCGGG-C3，下游引物5′-CCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-C3。寡核苷酸内参末端用C3封闭，以阻止延伸反应。

PCR 反应体系10μl，包括 DNA 模板1μl，10 ×PCR Buffer 1μl，10mmol/L dNTP 0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，上下游引物(10pmol/μl)各 0.1μl，1 × 饱和荧光染料 0.8μl，寡核苷酸内参总共0.15μl(包括高温寡核苷酸内参与低温寡核苷酸内参4个片段)，去离子水补充总体积至10μl。PCR反应条件:95℃预变性5分钟后进入主循环，95℃变性30秒，退火30秒，72℃延伸6秒，共35个循环，72℃延伸7分钟。之后进行HRM分析前的变性和复性处理，95℃ 30秒，25℃2分钟，94℃ 30秒，24℃ 4分钟。

1.2.3 HRM检测:将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Lightscanner TMHR-I 96上进行HRM分析:从40℃开始，以0.3℃/秒的斜率采集熔解曲线。到98℃结束，用LightScanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，判定基因型。

1.2.4 测序验证:基因分型采用根据HRM分析的不同陆线确定不同的基因型，从所得的不同基因型的个体中分别随机抽取5例样本进行测序验证。测序样本重新进行PCR扩增，测序引物为:rs1465618上游引物 5′-CCTAAAGCCAAAACAGCA-3′，下 游 引 物 5′-AGTTCCAAAGAATGAAGACC-3′，退火温度53℃;rs17021918 上游引物5′-ACCTCCCAAGGTAACCTC-3′，下游引物 5′-TTTCTCCCCATAACCACTA-3′，退火温度 52℃;rs7679673 上游引物 5′-TGTACCTTGAGGTTTACAGATC-3′，下 游引 物 5′-CCCTAAAAGGAACACACAG-3′，退火温度 53℃;rs1859962 上游引物 5′-CCTTGGACCAGTTCTTGA-3′，下游引物 5′-GGGAAATTTAGCCCCATTAT-3′，退火温度55℃。PCR反应体系50μl:DNA 模板 5μl，10 × PCR Buffer 5μl，10mmol/L dNTP 1μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl，去离子水补充总体积至 50μl。PCR 反应条件:95℃预变性5min后进入主循环，95℃变性30秒，退火45秒，72℃延伸60秒，35个循环，之后72℃延伸7分钟。PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察合格后，送华大基因公司测序验证。

图1 8q24基因rs1465618，rs17021918，rs7679673和 rs1859962HRM分型图(HRM曲线)

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0软件处理数据。运用Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)检验研究样本的群体代表性。用比数比(OR)值及其95%置信区间评价相对风险。计量数据以表示，组间比较采用两个独立样本t检验或Mann-Whitney U秩和检验，组间基因型频率及等位基因频率比较采用 Fisher′s或 Pearson′s χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。采用SHEsis软件进行连锁不平衡分析，以P＜0.05说明存在连锁不平衡。

2.结果

2.1 HWE定律吻合度检验 经HWE检验，在对照组中rs1465618，rs17021918，rs7679673 和 rs1859962多态性位点的基因型频率P＞0.05，表明研究来自同一群体，具有较好的群体代表性。

2.2 分型结果 通过 HRM基因分型系统，SNPs rs1465618，rs17021918，rs7679673 和 rs1859962均有 3种基因型，每种基因型的溶解曲线差异非常明显(图1)。在每种基因型携带者中选5例进行测序验证给出至少一个测序图表，进行基因型的确定以及HRM分型结果准确性的评估。HRM分型的结果与测序的结果完全吻合，准确率为100%。测序结果进行网上BLAST比对，序列完全一致。

2.3 PCa候选基因关联分析 rs1465618，rs17021918，rs7679673和rs1859962的基因型和等位基因型在PCa组和对照组间的分布均无统计学差异(P＞0.05)。结果见表1。

2.4 PCa相关质量表型和基因型的关联分析 依照PCa

患者的质量性状(表型)，包括患者的临床特征、PSA、年龄、肿瘤分期和烟酒等8类观察指标，这些指标与这4个SNPs位点的各基因型都无关，关联分析结果见表2。为检测PCa关联基因型的遗传模型，我们采用了显性和隐性两种模型表中只有一种模型数据分析。

表1 THADA、PDLIM5、SLC22A3和染色体17q24区4个SNPs的基因型和等位基因在PCa组和对照组中的分布

表2 PCa患者表型与4个基因型的关联分析

3.讨论

近年来，随着中国人口老龄化以及生活条件的改善，PCa的发病率呈显著的上升趋势，已经成为中国老年男性最常见的恶性肿瘤之一。PCa的遗传流行病学发现:许多因子包括遗传和膳食因素被证明与PCa的发生密切相关，PCa位居第4位，仅次于唇黑色素瘤，皮肤黑色素瘤和卵巢癌［6］。由此可见，遗传因素在PCa的发生中起着重要的作用。

PCa的具体病因仍然不清，主要危险因素有老年、家族史和遗传等。年龄因素是不可变因素，肿瘤发生与衰老和机体退行性变有关，如，PCa在＜45岁人群中罕见，但随年龄增长，PCa发病率逐渐增加，PCa患者的平均诊断年龄为70岁［7］。尸检研究揭示，50岁男性中PCa患者占30%，70岁男性约80%患PCa［8］。另一不可变因素是遗传因素。

THADA基因位于染色体2p21上，最早被发现是甲状腺腺瘤靶基因，与甲状腺腺良性肿瘤相关［9］;PDLIM5(PDZ and LIM domain 5)，这是由于该基因其他剪接体的编码蛋白N端含有PDZ功能域，C端含有三个LIM功能域，定位在4号染色体4q22-23上［10］;SLC22A3位于人类6号染色体上，编码运送阳离子有机化合物的载体蛋白，作用于强心剂中儿茶酚胺［11］，并且对阳离子药物例如二甲双胍作用于心肌层有重要意义;染色体17q24区域Sox9(SRY-related high mobility group-box gene9)基因是一种重要的早期胚胎发育相关基因，是与位于男性Y染色体上的SRY基因(Sex determine region of Y chromosome)同源的家族基因。而SRY基因不是直接调节睾丸的发育而是通过Sox9共同作用才发生作用［12］。本研究联合分析 THADA(rs1465618)、PDLIM5(rs17021918)、SLC22A3(rs7679673)和染色体17q24区(rs1859962)4个重要的PCa相关基因，并观察了各自贡献PCa发生风险的独立作用。虽然每一基因均有多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，但在遗传病因学研究中，通常在证据(文献报道和预实验等)基础上选择候选基因，作为疾病关联研究的策略之一，本组也采用了同样的研究策略。但本研究表明THADA(rs1465618)、 PDLIM5(rs17021918)、 SLC22A3(rs7679673)和染色体17q24区(rs1859962)与中国北京PCa患病风险无相关性(P＞0.05)，而且基因型与部分表型分析表明与PCa患者的年龄、Gleason评分、PSA浓度及烟酒等均无相关性(P ＞0.05)。

由于本研究存在样本量较小这一局限性，对于THADA(rs1465618)、PDLIM5(rs17021918)、SLC22A3(rs7679673)和染色体17q24区(rs1859962)和与中国北京人PCa发生相关性的最终定论，还需在其他群体的更大样本中进行进一步验证，以便为PCa的病因学研究奠定理论基础。

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