乳腺癌干细胞的基础及临床应用研究进展

刘祥伟，曲延玉（综述），陈德滇，杨庄青（审校）

（1.昆明医学院第三附属医院乳腺科，昆明 650118;2.楚雄医专基础医学系，云南楚雄 675005）

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。在肿瘤的治疗中，从肿瘤的起源上来寻求病因学治疗一直是人们研究的热点。研究发现许多类型的肿瘤（包括乳腺癌）都是由类似干细胞的细胞分化而来。因此，人们在干细胞的理论基础上提出了肿瘤干细胞学说。在乳腺癌的治疗中，一直没有关于乳腺癌的病因学治疗的明确报道。自从2003年人们首次从乳腺癌组织中分离出乳腺癌干细胞［1］至今。这些细胞在肿瘤的转移和治疗后的复发中所起的作用备受关注。

1 乳腺癌干细胞的发现与分离方法

1.1 乳腺癌干细胞的发现 2003年，Al-Hajj等［1］在有乳腺癌生长的免疫低下小鼠模型的研究中发现，只有少数的细胞能够发生肿瘤。尽管成千上百万的细胞中仅有100个能够发生肿瘤，但是这些细胞在导致肿瘤发生的每个阶段都能够发生作用。并且从这些细胞中分离CD44+CD24

－/lowLin－细胞群。这些细胞诱导肿瘤的发生，在不同阶段发生作用，所以能为临床治疗提供很好的依据。此外，Kondo等［2］又从 MCF-7细胞系中分离出侧亚群（side population，SP）细胞。Hemmati等［3］和 Singh 等［4］分别从人的脑肿瘤组织中以球形培养的方法分离出具有干细胞特性的细胞群体，并表达CD133表面标志。

1.2 乳腺癌干细胞的分离与培养 SP可能是一种普遍的干细胞表型，之所以在乳腺癌细胞中发现是由于细胞膜上的乳腺癌耐药蛋白可泵出细胞内Hoechst33342染料使其呈现淡染。Alvi等［5］从人和小鼠的正常乳腺上皮细胞中也分离出SP细胞，比率为0.20%～0.45%，在体内外可进一步分化为乳腺组织。根据这种方法，Kondo 等［2］尝试从多种肿瘤细胞系中分离SP细胞，包括 C6、B104、Hela和人乳腺癌细胞系MCF-7，其中SP细胞在MCF7中的比率约为2%。

Al-Hajj等［1］用8周龄的雌性NOD/SCID小鼠作为实验对象，用氯胺酮/赛拉嗪对小鼠进行全麻，用VP-16腹膜注射，使小鼠荷瘤。培养后分离出具有干细胞活性的CD44+CD24

－/lowLin－细胞群体。这类干细胞经小鼠体内传代，其自我更新和成瘤能力不变，每代均可重新形成包含干细胞和非干细胞表型的异质性细胞群体。在A1-Hajj等的实验中还发现，干细胞比例最小的肿瘤细胞移植于小鼠体内后生长也最为缓慢。在儿童神经系统肿瘤中，髓母细胞瘤比星形胶质细胞瘤恶性度高，前者干细胞比率占1%，后者占25%。由此推断，肿瘤干细胞的数量可能与肿瘤的恶性程度相关。上皮细胞间质中各成分的相互作用对肿瘤的浸润和转移起决定作用［6］。CD44编码人染色体11p13，有 2 种表型，标准型 CD44s和变异型 CD44v［7，8］。CD44的作用与CD24有关。然而，人乳腺癌具有异质性，并且只有1/3具有CD44+CD24

－/lowLin－表型，并具有干细胞的特性。这类肿瘤细胞在基底样肿瘤和BRCA1 遗传性乳腺癌中较多［9，10］。

2 乳腺癌干细胞的特点

研究中发现，肿瘤干细胞与正常干细胞有许多相似点。许多学者都认为，肿瘤干细胞是由正常干细胞基因突变而来。其相似点主要表现在以下几方面［11］:①正常干细胞和肿瘤细胞都有自我分化能力和分化潜能。②正常干细胞和肿瘤干细胞都有对称分裂与不对称分裂两种分裂方式。③正常干细胞和肿瘤干细胞有相似的生长调控机制，而正是其中某些信号调节通路，如 Wnt、Notch、SHH（sonic hedgehog）通路等转导异常最终导致肿瘤的发生。④正常干细胞具有迁移到特定组织和器官的能力，而肿瘤干细胞有转移的能力。⑤正常干细胞与肿瘤干细胞都具有端粒酶活性以及扩增的端粒重复序列，而人类终末分化体细胞不具有端粒酶活性。

与正常乳腺干细胞相比，乳腺癌干细胞有自己的特性。表现在以下几个方面:①正常的乳腺干细胞的增殖具有稳定性，其自我更新具有负反馈调节机制，增殖和分化处于平衡状态，而乳腺癌干细胞增殖是无序的、失控的。②与正常的乳腺干细胞相比，乳腺癌干细胞缺乏分化成熟的能力，所以包括乳腺癌在内的大多数肿瘤往往是低分化的。③乳腺癌干细胞具有积累复制错误的倾向，而正常的乳腺干细胞可通过多种途径防止这种情况发生。④乳腺癌干细胞在显微镜下有肿瘤细胞形态，即具有细胞异型性、细胞核大、核深染、核分裂等特点，而正常的乳腺干细胞在形态上仍为正常细胞。

3 乳腺癌干细胞的研究思路

3.1 信号转导方面 主要在 Notch、Wnt、Hedgehog通路等的研究较多。Notch是通过与邻近细胞上的Notch配体相互作用产生的，是对多种不成熟细胞分化的抑制信号。Dontu等［12］发现，乳腺癌干细胞中4种配体的表达均为分化细胞的2～4倍。随着细胞的分化而表达下调，Notch信号的激动剂使原代乳腺干细胞球的体积明显增加，相反，加入Notch4抗体则明显变小，甚至完全阻断了二代细胞的生长。Notch途径与乳腺癌相关，转导了Notch4胞内基因的小鼠乳腺不能正常发育，也不能在孕期产生乳腺小叶，7个月内即进展为低分化腺癌。在人的乳腺癌细胞系BT474、Hs578T有Notch4胞内段的表达。

Wnt信号通路在多种生物的胚胎发育、组织器官形态、细胞命运决定、细胞增殖、分化、迁移、凋亡中发挥重要作用，已发现其在多种干细胞维持自我更新过程中发挥作用，并与多种肿瘤存在密切关系［13］。Brennan 等［14］实验表明，缺乏 Wnt/B-catenin通路转录因子LEF的基因剔除小鼠和表达Wnt信号抑制剂Dickkopf的小鼠乳腺均不能发育。这表明Wnt信号途径在乳腺芽胚中对维持干细胞池起作用。研究表明，Wnt通路的活化促进了乳腺干细胞的自我更新，引起了乳腺干细胞比例的增加［15］。乳腺癌干细胞高表达 Wnt-1、下游分子 β联蛋白［16，17］。COMMA-D β-geo（CDβgeo）乳腺癌细胞株转染 β联蛋白后形成乳腺微球体的比例增加。这些结果表明，Wnt通路的活化可能通过干扰乳腺干细胞正常的自我更新，优先诱导乳腺干细胞异常增殖、转化，最终导致乳腺肿瘤的形成。对Wnt-1转基因鼠干细胞比例、干细胞标志物、分化标志物的研究支持了这种假说。

Hedgehog在乳腺干细胞、乳腺癌干细胞高表达［18］。Patrawala 等［17］采用反转录-聚合酶链反应检测，发现从MCF-7乳腺癌细胞系中分离出的SP比非SP表达更高水平的Notch-1。Hedgehog通路中的许多分子被称为癌基因或抑癌基因。这些在乳腺癌的研究中报道不多，Chang Claude等［19］发现 Ptcl基因的3'端编码区存在天然的多态性，且与口服避孕药引起的乳腺癌的患病风险增加有关。该通路的具体作用机制尚未完全明确，可能是Ptcl缺失减少了对Smo的抑制作用，激活Hedgehog信号途径，使细胞进入异常的增殖周期，细胞凋亡减少。

除以上信号转导途径外，尚可存在其他信号转导途径。PTEN是近年发现的抑癌基因，因与细胞骨架蛋白tensin同源，而具有抑制侵袭、转移的作用。Tunici等［20］在小鼠体外培养的脑胶质瘤干细胞神经球中发现了PTEN的杂合性缺失，首次证明了PTEN很可能与肿瘤干细胞的发生发展有关。

3.2 雌激素及其受体在乳腺癌干细胞中的作用近年的研究及临床治疗经验提示，乳腺癌的发生与发展与雌激素的存在有相关性。Dontu等［21］提出了乳腺干细胞发育模型。胚胎期雌激素受体（estrogen receptor，ER－）乳腺干细胞产生肌上皮祖细胞和导管上皮祖细胞构成胚胎期乳腺发生的基础，此阶段不需雌激素的作用;在胎儿后期，从ER+乳腺干细胞分化出ER+乳腺祖细胞，在青春期、怀孕期升高的雌激素水平作用下，ER+乳腺祖细胞可以产生ER+和ER－瞬时增殖的细胞群体，支持乳腺导管的发育和分支的形成。增殖后，细胞表面ER表达下调，经历进一步的分化。由此根据肿瘤起源将乳腺癌分为三种类型:①由最原始的ER－干细胞转化而来，ER+细胞比例＜10%，表达导管上皮和肌上皮标志，分化差，抗雌激素治疗无效，激素替代治疗也不会增加乳腺癌的风险。②也由ER－干、祖细胞转化来，但尚可分化成ER+细胞，比例为10%～100%。抗雌激素治疗可抑制ER+细胞的增殖，起初会使瘤体缩小，但随着ER－干细胞继续增殖及可能有新的突变下调ER的表达，激素治疗逐渐失效，激素替代治疗不会对肿瘤有明显的影响。③由ER+祖细胞转化而来，只表达管腔上皮表面标志，分化好，抗雌激素治疗有效，激素替代治疗促进疾病进展。这种模式有助于理解雌激素与肿瘤发展和治疗的关系，但仍需待分离出纯化的乳腺干细胞和乳腺癌干细胞后才能得到直接的验证。

3.3 最新的研究进展

3.3.1 细胞周期蛋白D1 乳腺癌可以分为两种类型:一种是导管癌，这类癌对激素敏感，也是最常见的乳腺癌类型，并且生长缓慢。另一种是基底样癌，这类癌对激素不敏感，生长转移快，预后差。研究发现，乳腺导管癌起源于小叶祖细胞（小叶祖细胞是一种能够产生小叶样结构，并具有在妊娠期及哺乳期分泌乳汁的作用）;在实验中发现，抑制这些小叶祖细胞的必需蛋白质能够阻止小鼠肿瘤细胞的形成。同时，还发现，这些祖细胞依赖于细胞周期蛋白D1的活性。研究中应用带有无活性细胞周期蛋白D1和一种促进乳腺导管癌发生的基因的小鼠模型;引用这个模型发现仅有极少数的小叶祖细胞生成，而且能避免乳腺导管癌的发生［22］。由此可以推断，抑制细胞周期蛋白D1，或许能够抑制乳腺癌干细胞向乳腺导管癌的发展。

3.3.2 CXCR1密西根大学综合癌症中心的研究者在研究中发现，用抗体或者一些小分子物质（如repertaxin）抑制细胞表面蛋白CXCR1，能导致肿瘤干细胞的衰竭。而肿瘤干细胞的选择性衰竭能够减少肿瘤的生长或者转移［23］。因此，可以认为这两种物质对肿瘤干细胞可能有抑制作用。这可能会成为肿瘤治疗中的突破点。

4 乳腺癌干细胞与临床

肿瘤干细胞因能高表达ABC转运体，能将化疗药物泵出细胞外，因此有研究者认为肿瘤干细胞对化疗有抵抗性。同时，残留的未被杀死的肿瘤干细胞也成为复发的根源。Giatromanolaki等［24］的研究中发现，CD44s与CD24的表达和人表皮生长因子受体2、ER、孕激素受体的表达与血管生成有关系。Abraham 等［25］的研究认为，CD44+/CD24－乳腺癌细胞与患者的转移有关系，但是与患者的临床预后无关系。Mylona等［26］用免疫组化双染的方法对136例浸润性乳腺癌的患者进行了CD44+/CD24－和CD44－/CD24+与乳腺癌转移及预后的关系研究，其研究表明CD44+/CD24－与淋巴结的转移及肿瘤的分级呈负相关，与患者的生存率呈正相关;而CD44+/CD24－与临床病理分级无关系，与患者的生存率呈负相关。因此，CD44+/CD24－将会是乳腺癌干细胞研究中新的突破点。

5 展望及存在的问题

通过以上的研究可以发现，许多学者对细胞表面因子、细胞信号转导、激素相关性肿瘤的激素水平与肿瘤发生发展的关系，及细胞周期蛋白对乳腺癌干细胞的作用作了很多研究，取得了可喜的成果。因肿瘤干细胞分化的途径中存在某些特征蛋白或细胞因子，用这些表面蛋白或者细胞因子作为抗原，应用针对该抗原的单克隆抗体，针对性中和细胞表面抗原（或者细胞因子）等，改变乳腺癌干细胞的微环境，可能选择性地阻断这些蛋白质或者细胞因子的表达，抑制肿瘤的发生或减轻现有肿瘤的症状和肿瘤细胞的相对数量。因此，这种中和细胞表面蛋白或者相关细胞因子的针对性治疗，有望在乳腺癌靶向治疗中取得突破性进展，并可能在对乳腺癌的临床治疗和减轻化疗不良反应方面起到理想的效果。但是，乳腺癌干细胞的相关研究仍有很多问题存在。乳腺癌干细胞在乳腺组织中的含量较少，对于其特异性表面标志物的认识仍存在分歧，分离技术尚不完全成熟，这将是当前科研的主要工作之一。

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