多聚(ADP-核糖)聚合酶与糖尿病周围神经病变

赵 丽 梁晓春

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheralneuropathy,DPN)是糖尿病最常见的慢性并发症之一,常导致糖尿病足的发生,是造成糖尿病患者致残、致死的主要原因之一[1]。DPN发病机制复杂,目前认为与神经微循环障碍、氧化应激、代谢异常、神经营养因子缺乏、炎症、免疫机制异常等因素有关,但迄今为止尚无一种学说能够完全揭示 DPN的发生和发展,临床亦缺乏特异性治疗方法及药物。多聚(ADP-核糖)聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)是一类催化聚 ADP核糖化的核酶,广泛存在于除酵母外所有真核细胞中,具有修复 DNA损伤、调控基因转录、促细胞分裂和维持染色质及基因组稳定等生理功能[2]。此外,PARP还被证实参与心血管疾病、炎症、衰老、肿瘤等病生理过程[3]。近期国外实验研究发现,PARP在 DPN的发生发展中同样具有重要作用。

一、PARP在糖尿病周围神经病变中被过度激活

PARP的生物学功能与其作为 DNA损伤的感受器和信号分子有关,PARP中的锌指结构能够识别DNA单链或双链断裂的缺口,并启动 PARP的催化活性。糖尿病的高糖环境可以刺激细胞生成大量活性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS),攻击 DNA造成DNA单链或双链断裂,从而激活 PARP。PARP激活后与 DNA缺口形成二聚体,以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)为底物裂解成为烟酰胺和 ADP,然后转移ADP至靶蛋白,催化靶蛋白发生聚腺苷二磷酸核糖基化,进而形成多聚 ADP核糖化蛋白。Li[4]首次应用免疫蛋白印迹法分析大鼠坐骨神经中由 PARP催化产生的多聚 ADP核糖化蛋白含量,结果显示由STZ诱导的糖尿病组蛋白含量比正常对照组升高74%。Schwann细胞是周围神经系统特有的胶质细胞,在维持神经结构和功能以及修复损伤具中有重要作用,在同一报道中,体外高糖条件(30mmol/L葡萄糖)培养的人 Schwann细胞多聚 ADP核糖化蛋白的含量也均较正常细胞显著升高。Victor[5]同样在 2型糖尿病肥胖(ob/ob)小鼠的背根神经元(DRG)中发现多聚 ADP核糖化蛋白的免疫阳性表达较正常小鼠显著增强。这提示在 DPN时周围神经中的 PARP被过度激活。

二、PARP过度激活对 DPN神经血管的影响

DPN的一个重要病理机制即神经滋养血管及神经内外膜毛细血管结构改变和功能障碍,使神经内膜缺血、缺氧,影响神经细胞正常的生理代谢过程,导致神经组织慢性损伤。有离体实验显示,在高糖(30mmol/L葡萄糖)条件培养的人血管内皮细胞中,多聚 ADP核糖化蛋白含量较正常细胞明显增多,PARP被过度激活[4]。多项在体实验证实,结构不同的 PARP抑制剂均可以不同程度地提高 STZ-DPN大鼠周围神经血流速度(NBF),改善周围神经内膜血流状态[6,7]。Shyam[8]应用激光多普勒方法观察神经血流变化时发现,STZ-DM大鼠成模 6周时 NBF较正常大鼠降低 63%,而经过 PARP抑制剂 4-ANI干预 1周和 2周后,STZ-DM大鼠 NBF分别提高 63%和68%。

三、PARP过度激活对 DPN周围神经功能和结构的影响

DPN可引起神经传导速度减慢、热痛觉和机械痛觉异常等神经功能障碍,典型的神经病理表现为节段性脱髓鞘、轴突变性和神经纤维缺失。

Irina[6]发现 STZ-DM小鼠模型中,野生型 PARP(+/+)鼠在成模 17天后就出现运动神经传导速度(MNCV)和感觉神经传导速度 (SNCV)减慢,而PARP(-/-)鼠的 MNCV和 SNCV始终表现正常水平。对早期 DPN大鼠应用 PARP抑制剂 PJ34干预后,可以使 MNCV和 SNCV均提高 98%[7]。

Olga[9]发现 STZ诱导成模 4周的糖尿病大鼠即存在热痛觉和机械痛觉过敏,如果在成模 2周后给予PARP抑制剂 ISO治疗 2周,大鼠热痛阈和机械痛阈可以得到部分改善。最新的实验报道 STZ-DM大鼠在 12周时表现出明显的热痛觉、机械痛觉超敏及自发性疼痛;如果在成模 2周后给予 PARP抑制剂GPI-15427治疗 10周,可以部分改善痛觉超敏,减轻自发性疼痛。与上述比较,相同病程的糖尿病PARP(-/-)大鼠则始终表现为基本正常的热痛阈和机械痛阈[10]。进一步深入研究发现,12周病程的糖尿病 PARP(+/+)小鼠出现表皮内神经纤维缺失,而相同病程的糖尿病 PARP(-/-)小鼠则表现为正常的表皮内神经纤维密度。

四、PARP过度激活参与 DPN的可能机制

PARP过度激活的致病作用可能与其激活过程的不同阶段相关:聚 ADP核糖化影响靶蛋白功能;从聚 ADP糖基化蛋白裂解出的 PAR寡聚体发挥不同的细胞学效应;PARP与核蛋白联合形成功能性复合物;细胞内底物 NAD+水平降低等。根据近年的实验结果,PARP过度激活参与 DPN的机制可能有如下几个方面:

1.PARP与能量耗竭。PARP过度激活后,大量消耗细胞内聚 ADP核糖化反应底物 NAD+和 ATP,使细胞能量衰竭,导致细胞功能障碍,使神经跨膜电传导缺乏能量支持,从而导致神经传导速度下降。研究提示糖尿病大鼠坐骨神经组织中 ATP、NAD+、NADH、肌酸(Cr)、丙酮酸等能量代谢指标均较正常大鼠表现异常,而这些异常指标均可被 PARP抑制剂改善[7]。

2.PARP与细胞凋亡。神经细胞凋亡增多是DPN主要病理表现之一。前文已述,PARP过度激活可大量消耗细胞能量,这可使 NAD+和 ATP过度缺乏从而诱发细胞凋亡。细胞凋亡的执行器为 caspase级联反应,最终均有 caspase-3的活化。研究发现PARP是活化了的 caspase-3的底物之一,PARP裂解作为 caspase激活的分子事件,被认为是细胞凋亡的一个早期标志[11]。不仅如此,也有实验证明 PARP过度激活可以触发非 caspase途径依赖的细胞凋亡信号机制,通过诱导细胞线粒体释放凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF),引起细胞核 DNA大规模片段化及细胞凋亡的发生[12]。

3.PARP与氧化 -硝化应激反应。根据 Brownlee[13]提出的糖尿病血管并发症统一发病机制假说,血管内皮细胞的线粒体电子传递链在高糖条件下发生氧化应激反应,3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性被抑制,继发下游多元醇通路、蛋白激酶 C通路、氨基己糖通路激活和糖基化终产物增加等 4条经典途径,从而导致血管并发症的发生。重要的是,进一步研究发现,正是由于 PARP被过度激活,修饰GADPH使其发生多聚 ADP核糖化,从而使 GADPH活性受到抑制[14]。这提示 PARP过度激活在糖尿病血管病变发病的上游机制中扮演着关键角色。

DPN时 RNS/ROS水平升高可导致蛋白质络氨酸硝基化损伤,生成 3-硝基络氨酸(nitrotyrosine,NT)。NT可以通过 H2O2介导 DNA损伤,引起蛋白质空间结构变化,导致周围神经功能和结构异常;络氨酸磷酸化在细胞信号转导中具有重要作用,而络氨酸硝基化后可以抑制其磷酸化,导致神经细胞信号转导过程失控。实验研究发现[9,15,16],在 DPN大鼠坐骨神经、背根神经元以及体外高糖环境下培养的人Schwann细胞中,NT表达均明显增高,而这种表达均可以被不同的 PARP抑制剂所减弱,研究者认为这提示 PARP过度激活可以引起氧化 -硝化应激反应,推测其可能是 DPN早期重要的潜在发病机制之一。

五、PARP抑制剂的研究现状

按照结构不同,目前已经发现的 PARP抑制剂可分为异喹啉酮类、取代尿嘧啶类、苯并咪唑类、腺苷取代二氢异吲哚酮类、喹唑酮类、酞嗪酮类以及吡咯并咔唑类等。自 2005年起,PARP抑制剂已经在肿瘤、心血管疾病等领域进入临床试验阶段,而对 DPN的治疗作用研究目前仅限于基础实验观察[17]。此外,在炎症、心血管疾病领域中,已有实验证明黄酮、咖啡因代谢产物、人参等具有类 PARP抑制剂的作用[18～20]。新近的实验研究显示,二甲双胍可以抑制主动脉内皮细胞中由高糖诱导的 PARP过度激活,提示二甲双胍对血管内皮细胞的保护作用也可能是通过抑制 PARP活性来实现的[21]。辛伐他汀可以通过抑制 PGC-1α/ROS/PARP途径减轻视网膜血管的通透性、抑制毛细血管细胞的凋亡和新生血管生成[22]。

六、评价与展望

随着 PARP在糖尿病血管并发症统一发病机制中的关键作用被发现,PARP与糖尿病周围神经病变之间的关系逐渐引起学者关注及重视。近年多项实验研究已证实,PARP的过度激活在神经微循环障碍、神经功能减退、神经纤维缺失等方面发挥重要作用。其发生机制可能与 PARP过度激活导致细胞能量耗竭、促进细胞凋亡等因素有关。在 PARP与氧化应激相关研究中,多数学者认为高糖环境引起氧化 -硝化应激反应加剧,ROS/RNS攻击神经细胞 DNA导致单链或双链断裂,促使 PARP过度激活并修饰GADPH使其活性下降,继发下游 4条经典途径,从而导致 DPN的发生。但与之相反的是,有实验观察到在糖尿病大鼠的周围神经组织和细胞中 PARP过度激活的发生时间均早于氧化应激反应[4];亦有研究通过 PARP抑制剂可以减弱 NT过表达的实验现象,推测 PARP过表达可以引发氧化 -硝化应激反应。上述实验提示我们 PARP过度激活与氧化 -硝化应激之间可能存在相互作用关系,但二者究竟谁居上游,还需要继续深入研究探讨以明确,然而不管结论如何,都说明 PARP过度激活在 DPN的发生发展中有不可忽视的重要作用。另外,从理论上推测,PARP可以通过上调肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)和其他炎症因子的表达、激活脊髓和 Schwann细胞 P38 MAPK通路、损伤 Ca2+调节平衡和信号转导等途径引起周围神经痛和感觉异常,但目前尚未见到相关研究报道,还需要实验研究来获得证实。

关于 PARP抑制剂对 DPN的治疗作用研究仅限于实验室阶段,其在神经保护中长期使用的安全性和特异性还有待于进一步研究和评价,期待出现对PARP抑制剂远期疗效观察的证据。已有实验证明黄酮、咖啡因代谢产物、人参、二甲双胍、辛伐他汀等有抑制 PARP活性的作用,这些均对今后 DPN治疗策略和治疗方法的研究探索提供了有益的启迪。

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