生存素在肿瘤中的研究进展

徐淑梅，刘卓刚

(中国医科大学附属盛京医院血液科，沈阳 110021)

肿瘤的发生、发展是一个多因素、多步骤的生物学过程，一方面与细胞增殖的基因过度表达及分化调控紊乱有关，另一方面与调控细胞凋亡的基因异常有关。近年来，细胞凋亡与肿瘤关系成为研究的热门课题，生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族的成员，广泛表达于人的胚胎组织和多数肿瘤组织，具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的生物学功能，是联系细胞周期和细胞凋亡的重要因子。笔者就生存素的分子结构及生物学功能、生存素与肿瘤表达、生存素与癌基因、生存素与肿瘤治疗的研究进展作一综述。

1 生存素的分子结构及生物学功能

1.1 生存素的分子结构 生存素基因是AMBROSINI等［1］用效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell prorease recetpor-1，EPR-1)cDNA在人类基因组库的杂交筛选中分离出来，是IAP家族相对分子质量最小的成员，位于染色体17q25，全长14.7 kb。生存素基因包含4个外显子和3个内含子，编码142个氨基酸组成的相对分子质量为16 500的蛋白质。生存素具有独特的蝶形领结样结构，仅含一个杆状病毒 IAP重复序列(baculoviral IAP repeat，BIR)，位于生存素氨基端，为生存素发挥细胞凋亡作用所必需。羧基端不含有锌指状结构，而代之以一个含有42个氨基酸形成的α-螺旋结构。生存素的前体mRNA经过选择性拼接可产生不同的剪接变构体，具有不同的抗凋亡特性，一种是缺乏外显子3的生存素(生存素-ΔEx3)，另一种是保留了部分内含子2作为隐性外显子的生存素(生存素-2B)。生存素-ΔEx3保留抗凋亡特性，而生存素-2B的抗凋亡能力明显降低。

细胞周期依赖元件(cell-cycle dependent element，CDE)和细胞周期同源性区域(cell-cycle genes homology region，CHR)特异性存在于G2/M期表达基因。生存素基因在2 811 bp处有一个开放阅读框，基因上游2 560～2 920 bp是生存素基因的启动子，缺少TATA盒，富含GC，有3个CDE和1个CHR。生存素在G2/M期的表达可克服凋亡的“关卡”，通过有丝分裂促进细胞的异常增殖，提示生存素主要是G2/M期的调节基因。

1.2 生存素的生物学功能 细胞凋亡主要是通过效应蛋白酶(Caspase)来实现的，体外实验证明，生存素可特异结合于细胞凋亡蛋白酶的终末阶段分子Caspase-3、Caspase-7［2］，发挥抑制凋亡的作用。肿瘤细胞表达生存素不仅可以阻断Fas介导的凋亡信号途径来逃避免疫细胞的杀伤，如细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和自然杀伤(natural killer，NK)细胞，而且可以通过增强Fas配体的表达反过来抑制免疫细胞的杀伤作用［3］。生存素的磷酸化修饰是决定其功能的重要因素。生存素的磷酸化位点是34位的苏氨酸(threonine 34，Thr34)，在有丝分裂前、中期，生存素与有丝分裂激酶P34 cdc2-CyclinB1在装配体上形成复合体并被其在Thr34上磷酸化，Thr34磷酸化的生存素与 Caspase-9形成生存素/Caspase-9复合体发挥抗凋亡作用，而Thr34非磷酸化导致生存素/Caspase-9复合体从装配体上解离，释放出Caspase-9导致细胞凋亡。生存素还可以通过与Smac/DIABLO(即第2个线粒体来源的胱氨酸酶激活剂或低等电点IAP直接结合蛋白)作用，使XIAP活性增加，XIAP直接与Caspases结合达到抑制凋亡的作用;通过抑制p53、p21的功能阻断凋亡过程［4］。

生存素不但具有抑制细胞凋亡的作用，而且参与细胞有丝分裂的调节和细胞质分裂。有丝分裂初期，生存素与有丝分裂纺锤体微管蛋白特异性结合，抑制Caspase活性，降低凋亡的发生，维护有丝分裂的正常进行。干扰生存素和微管蛋白的反应，可使生存素抗凋亡活性丧失，增加Caspase-3的活性，导致细胞的G2/M期凋亡，细胞分裂异常，伴有多倍体细胞形成。在细胞周期的G2/M期，生存素能对抗异常因素诱导的细胞凋亡，而肿瘤细胞生存素的过度表达，能使细胞克服这个凋亡的调控点而利于转化细胞，完成异常的有丝分裂。生存素也可与p21蛋白结合于中心粒上，使p21聚集在中心粒上，减弱p21对细胞周期的负性调节，使细胞周期缩短［4］。

研究显示，生存素还参与血管形成过程，应用血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(buck fibroblast growth factor，bFGF)诱导静止期的内皮细胞，结果血管内皮细胞内生存素含量升高16倍，6～10 h达峰值，24 h开始下降。炎症因子、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和白细胞介素(interleukin，IL)-1未能诱导血管内皮细胞内生存素的表达，提示生存素可能是血管形成中生长因子诱导的保护性基因，维持血管内皮细胞的正常增殖。

2 生存素与肿瘤表达

生存素主要分布于胚胎及分化未成熟的组织中，在成人体内除胸腺、甲状腺、子宫内膜组织、生殖腺中有微量表达外，所有分化成熟的组织，包括外周血白细胞、淋巴结、脾、胰、肾、骨骼肌、肝、肺、脑以及心脏组织中均无表达。很多实体瘤和造血系统恶性肿瘤中都检测到生存素的高表达，且表达阳性患者的生存率相对阴性患者明显降低，复发率则升高，与预后密切相关。体外实验在多种肿瘤细胞系中也检测到生存素的高表达。美国国立癌症研究中心使用的60种肿瘤细胞系的检测结果显示［2］:生存素在60种肿瘤细胞系中普遍高表达，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤等，其中在乳腺癌及肺癌表达最高，肾癌表达最低。

3 生存素与癌基因

3.1 生存素与p53 野生型p53是生存素的负调控基因，能够结合在生存素启动子上，从而抑制生存素的转录，推测在生存素启动子上可能存在p53基因结合位点，生存素参与了p53依赖性凋亡通路［5］。p53是bcl-2的上游调控基因，在正常情况下，野生型p53可以在转录水平上下调bcl-2，促使细胞发生凋亡，bcl-2水平的下调直接或间接的影响了生存素的表达［6］。

3.2 生存素与bcl-2 bcl-2是重要的细胞凋亡调节因子，通过对抗引起线粒体破裂的离子失衡，阻断细胞色素C从线粒体向细胞质释放，在Caspase级联反应上游防止其活化，保持线粒体完整性。生存素主要是抑制Caspase-3和Caspase-7的活性，与bcl-2都可在线粒体水平参与抗凋亡，并具有协同性。此外，生存素基因与bcl-2基因都是由TATA的富含GC启动子调节的［注:T为胸腺嘧啶(thymine)，A为腺嘌呤(adenine)，G为鸟嘌呤(guanine)，C为胞嘧啶(cytosine)］，转录激活后均能增强细胞增殖，生存素基因所在的17q25染色体不稳定，此位点可能涉及t(14;18)易位而导致bcl-2基因转录激活。ANGILERI等［7］对神经胶质瘤抗凋亡基因的研究中发现，8例低级星形细胞瘤中生存素与bcl-2都是高表达，证实二者抗凋亡的协同性。

3.3 生存素与Bax Bax基因属凋亡活化基因，转染Bax基因能修饰肿瘤细胞的恶性表型，Bax基因突变存在于多种恶性肿瘤，提示Bax基因也属抑癌基因。研究发现，将Bax基因与生存素基因协同转染肿瘤细胞系，其共同诱导的细胞凋亡比单纯Bax基因转染减少1/3，表明生存素基因可拮抗Bax基因的促细胞凋亡作用［7］。Bax过度表达诱发线粒体释放细胞色素C，激活Caspase-9，Caspase-9又激活下游的 Caspase-3和Caspase-7。生存素可以影响Bax的表达，阻滞由Bax介导的细胞色素C向细胞质释放，从而抑制细胞凋亡［8］。

3.4 生存素与磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN) 生存素与PTEN均参与细胞周期调控和细胞凋亡，两者作用环节一致，但生物学效应相反。研究发现，生存素与PTEN在肿瘤中的表达可能存在负性相关，肿瘤恶性程度越高，生存素基因表达越高，而PTEN表达越低。推测其机制是生存素的表达受PI3K/Akt信号转导途径调控，而PTEN在正常生理情况下抑制PI3K/Akt通路，从而抑制生存素的表达。当组织发生恶变，PTEN表达下调或缺失时，其对PI3K/Akt通路的抑制作用削弱，生存素表达上调［6］。生存素基因沉默和PTEN介导的肿瘤抑制密切相关［9］。

4 生存素与肿瘤治疗

生存素表达水平下调可以直接调节肿瘤细胞自身凋亡，增加肿瘤细胞对化疗或放疗敏感性，增强化疗或放疗等对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。生存素成为肿瘤治疗的关键靶点。

4.1 反义技术 应用反义策略阻断生存素表达，可明显抑制肿瘤细胞的增殖，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，诱导凋亡的发生，而对正常组织几乎没有不良影响，具有良好的靶向性、特异性和安全性。

4.1.1 反义寡核苷酸 OLIE等［10］设计了针对生存素mRNA不同区域的反义寡核苷酸，其中针对生存素的mRNA232～251 bp位置的反义寡核苷酸最有效，可使生存素的mRNA表达减少70%，并且治疗后的肿瘤对化疗的敏感性增加。反义介导的生存素基因敲除使得肿瘤细胞增殖明显受抑，反义寡核苷酸药物LY2181308已进入临床试验阶段。SPC3042通过下调生存素的表达，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，并同时能下调bcl-2的表达，具有更强的稳定性和抑制作用［11］。

4.1.2 核酶 靶向生存素的核酶载体转染后能使生存素表达下降。CHOI等［12］设计了针对生存素mRNA 279 bp和289 bp位置，能够特异降解生存素mRNA的两个棒状核酶(hammerhead ribozymes)，通过重组腺病毒导入乳腺癌细胞(MCF27)，结果发现导入的核酶能够有效降低生存素的表达，促进依托泊苷用药后的凋亡。PENNATI等［13］构建了表达靶向生存素的核酶载体，转染前列腺癌细胞DU145、PC3，稳定表达核酶的细胞较对照前列腺细胞生存素的表达量明显下降，并出现多倍体表型、Caspase-9依赖的凋亡，生存素表达的下调还导致前列腺癌细胞对顺铂的增敏，抑制接种于裸鼠的前列腺癌细胞形成肿瘤。

4.2 基因治疗 主要包括2种方法:一种是生存素显性失活突变体，将占优势的生存素显性失活突变体导入肿瘤细胞后，减少内源性生存素的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖。MESRI等［14］将含生存素突变体 T34A的腺病毒载体(Pad-T34A)注射到SCID小鼠体内的移植性人乳腺癌瘤体内，观察发现肿瘤细胞增殖明显受抑，通过转染生存素(Pad-T34A)能诱导HeLa细胞等5种肿瘤细胞凋亡，而对正常增生活跃的组织细胞(纤维母细胞、平滑肌细胞、内皮细胞)则无影响，结果证明生存素(Pad-T34A)可在体内和体外诱发凋亡。另一种是基于生存素基因启动子来促使肿瘤细胞中细胞毒基因表达。

4.3 小分子抑制剂

4.3.1 CDK抑制剂 cdc-2激酶抑制剂通过阻断cdc-2对生存素的磷酸化作用，可以抑制肿瘤生长和诱导凋亡。目前名为flavorpividol的药物己用于临床。

4.3.2 Hps90抑制剂 生存素的氨基酸序列赖氨酸(lysine，Lys)-7-Lys-90能与分子伴侣Hps90氨基末端结合，利于生存素稳定表达，目前普遍认为Hps90抑制剂，如17-AAG、shepherdin，能够下调生存素，起到靶向肿瘤治疗作用。Shepherdin能穿透细胞结合于Hps 90和生存素之间，占据ATP结合位点，松动client蛋白，启动凋亡途径和非凋亡途径致肿瘤细胞大量死亡;此外，shepherdin不会影响正常细胞活力和造血祖细胞的克隆形成能力。最近有研究报道，17-AAG能抑制与生存素负相关的26s蛋白酶体活性，反而使肿瘤细胞生存素的过表达，所以通过Hps90来抑制生存素表达还有待进一步探索［15］。

4.3.3 YM155 YM155可以诱导肿瘤细胞生存素表达的下调，有浓度-时间依赖性，能增加实体瘤对放疗的敏感性。YM155具有更强的抗肿瘤活性，是因为YM155用药后在肿瘤组织中的浓度比血浆中明显高，已进入临床实体瘤的试验治疗阶段［16］。

4.3.4 其他小分子抑制剂 研究证明其他小分子抑制剂也能间接抑制生存素的表达，包括信号转导子与转录活化子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)和T-cell factor的拮抗剂可以抑制生存素的转录，Erb B2的拮抗剂拉帕替尼(lapatinib)通过加速泛素-蛋白酶体介导的蛋白质降解抑制生存素表达。

4.4 靶向生存素的RNA干涉 RNA干涉(RNA interferencing，RNAi)能使生存素基因沉默，具有高度的特异性、稳定性、穿透性。SHEN等［17］通过构建干扰生存素的小发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)的表达质粒，并转染生存素高表达的胰腺癌细胞Patu8988。结果证明，生存素mRNA和蛋白均明显下降，并抑制Patu8988细胞增殖。质粒转染细胞的能力有限，YAN等［18］构建腺病毒表达载体的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，转染肝癌细胞HepG2后，生存素mRNA与蛋白表达下降率分别为72.34%和66.32%，说明构建腺病毒表达siRNA的表达系统有利于基因功能的基础研究和临床肿瘤治疗。靶向生存素的siRNA不仅能下调生存素的表达，还能增加肿瘤细胞对化疗的敏感性，通过抑制肺抗性相关蛋白(lung resistance related protein，LRP)逆转肿瘤耐药［19］。

4.5 免疫治疗 近年发现生存素在肿瘤免疫治疗中同样起着重要作用，能使被之修饰的树突状细胞等免疫细胞具有肿瘤组织靶向性。从生存素蛋白中分离出的人类白细胞抗原复合物A2亚型(HLA-A2)结合肽具有诱导肿瘤患者特异性T细胞免疫的功能。生存素诱导的CTL细胞能特异性杀伤表达阳性的肿瘤细胞，使其成为T细胞免疫的靶点，为肿瘤的免疫治疗提供了新策略［20］。

4.6 其他 生存素在细胞有丝分裂初期与纺锤体微管蛋白特异性结合，从而干扰和微管蛋白的反应，导致细胞凋亡，抗微管药物如长春新碱也可间接抑制生存素。

［1］ AMBROSINIG，ADIDA C，ALTIERI D C.A novel antiapoptpsis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma［J］.NatMed，1997，3(8):917-921.

［2］ TAMM I，WANG Y，SAUSVILLE E，et al.IAP-family protein survivin inhibits Caspase activity and apoptpsis induced by Fas(CD95)，Bax，Caspase，and anticancer drugs［J］.Cancer Res，1998，58(23):5315-5320.

［3］ KOICHI A，NAOKI T，TERUO E，et al.Survivin enhances Fas ligand expression via up-regulation of specificity protein 1-mediated gene transcription in colon cancer cells［J］.J Immunol，2004，172:3922-3929.

［4］ SAH N K，KHAN Z，KHAN G J，et al.Structural，functional and therapeutic biology of survivin ［J］.Cancer Lett，2006，244(2):164-171.

［5］ MITA A C，MITA M M，NAWROCKI S T，et al.Survivin:key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics［J］.Clin Cancer Res，2008，14(16):5000-5005.

［6］ ZHU N X，GU L B，LI F Z，et al.Inhibition of the Akt/survivin pathway synergizes the antileukemia effect of nutlin-3 in acute lymphoblastic leukemia cells［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(5):1101-1109.

［7］ ANGILERI F F，AGUENNOUZ M H，CONTI A，et al.Nuc-lear factor-κB activation and differential expression of survivin and bcl-2 in human grade 2–4 astrocytomas［J］.Cancer，2008，112(10):2258-2266.

［8］ OBEXER P，HAGENBUCHNER J，UNTERKIRCHER T，et al.Repression of BIRC5/survivin by FOXO3/FKHRL1 sensitizes human neuroblastoma cells to DNA damageinduced apoptosis［J］.Mol Biol Cell，2009，20(7):2041-2048.

［9］ GUHA M，PLESCIA J，LEAV I，et al.Endogenous tumor suppression mediated by PTEN involves survivin gene silencing［J］.Cancer Res，2009，69(12):4954-4958.

［10］ OLIE R A，SIMOES-WUST A P，BAUMANN B，et al.A novel oligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy［J］.Cancer Res，2000，60(11):2805-2809.

［11］ HANSEN JB，FISKER N，WESTERGAARD M，et al.SPC3042:a proapoptotic survivin inhibitor［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(9):2736-2745.

［12］ CHOIK S，LEE T H，JUNG M H.Ribozyme-mediated cleavage of the human survivin mRNA and inhibition of antiapoptotic function of survivin in MCF27 cells［J］.Cancer Gene Ther，2003，10(2):87-95.

［13］ PENNATIM，BINDA M.Ribozyme mediated inhibition of survivin expression increases spontaneous and drug induced apoptosis and decreases the tumorigenic potential of human prostate cancer cells［J］.Oncogene ，2004，23(2):386-394.

［14］ MESRIM，WALL N R，LI J，et al.Cancer gene therapy using a survivin mutant adenovirus［J］.Clin Invest，2001，108(7):981-990.

［15］ CHEUNG C H，CHEN H H，CHENG L T，et al.Targeting Hsp90 with small molecule inhibitors induces the overexpression of the anti-apoptotic molecule，survivin，in human A549，HONE-1 and HT-29 cancer cells［J］.Mol Cancer，2010，9:77.

［16］ SATOH T，OKAMOTO I，MIYAZAKIM，et al.Phase I study of YM155，a novel survivin suppressant，in patients with advanced solid tumors［J］.Clin Cancer Res，2009，15(11):3872-3880.

［17］ SHEN Y M，YANG X C，SONG M L，et al.Growth inhibition induced by short hairpin RNA to silence survivin gene in human pancreatic cancer cells ［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2010，9(1):69-77.

［18］ YAN G，DUAN R H，YIN K，et al.Inhibition of survivin expression to induce the apoptosis of hepatocarcinoma cells by adenovirus-mediated siRNA［J］.Bio Sci Trends，2008，2(2):88-93.

［19］ SONG X，WANG JB，YIN D L，etal.Down-regulation of lung resistance related protein by RNA interference targeting survivin induces the reversal of chemoresistances in hepatocellular carcinoma［J］.Chin Med J，2009，122(21):2636-2642.

［20］ SCHAUE D，COMIN-ANDUIX B，RIBASA，et al.T-cell responses to survivin in cancer patients undergoing radiation therapy［J］.Clin Cancer Res，2008，14(15):4883-4890.