唑来膦酸对多发性骨髓瘤成骨细胞增殖及其RANKL/OPG表达的影响

肖萍萍，陈君敏，叶德富

二膦酸盐是治疗骨髓瘤骨病(MBD)的主要药物，已有的证据认为二膦酸盐抑制破骨细胞(OC)前体增殖，抑制OC形成并诱导凋亡。但近年来研究发现二膦酸盐还能促进成骨细胞(OB)的增殖分化。二膦酸盐治疗MBD的作用是否通过改变细胞核因子κ-B受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κ-B ligand，RANKL)和护骨素(osteoprotegerin，OPG)表达水平，目前看法不一。为进一步了解二膦酸盐治疗MBD的机制，我们在多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者从骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)诱导分化的 OB加入唑来膦酸(zoledronic acid，第3代二膦酸盐)，考察其对OB增殖及OB表达RANKL和OPG的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 低糖DMEM培养基干粉和0.0025胰蛋白酶均购自Gibco公司，人淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品有限责任公司)，新生胎牛血清(Hyclone公司)，青、链霉素(Hyclone公司)，地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C均购自美国 Sigma公司，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(碧云天生物技术研究所)，Cell Counting kit(CCK-8，同仁化学研究所)，唑来膦酸(北京诺华制药有限公司)，引物合成(上海生工)，TRIzol液(Tri Reagent公司)，cDNA第一链合成试剂盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit#K1622，Fermentas公司)，PCR Master Mix(厦门泰京生物工程有限公司)，sRANKL ELISA Kit(美国 ADL公司)，OPG ELISA Kit(美国ADL公司)。

1.2 方法

1.2.1 人BMSCs分离培养及诱导形成OB 骨髓标本取自5例多发性骨髓瘤患者，密度梯度离心法分离单个核细胞，调整细胞密度为109·L－1，接种于25 cm2培养瓶，放入37℃，0.05 CO2培养箱，培养5 d后首次换液，以后每3天换液，每日倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。当细胞汇合到70%～80%时(约2周)，用0.0025胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代。本实验采用Kadiyala等［1］建立的OB诱导方法，将培养至第3代(约20 d)BMSCs采用条件培养基(维生素C 50 mg·L－1、地塞米松10－8mol·L－1和 β-甘油磷酸钠 10 mmol·L－1的低糖DMEM)培养基培养，采用碱性磷酸酶染色及钙结节等鉴定确认为OB。

1.2.2 唑来膦酸对OB增殖的影响 上述“1.2.1”实验收获的细胞采用低糖DMEM培养基制备5×107～10×107·L－1细胞悬液，接种于无菌 96 孔板中，每孔100 μl，含1×104个细胞。各实验组加入等体积不同浓度的唑来膦酸，混匀，使唑来膦酸终浓度分别为 10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol·L－1，每组设5个平行孔。对照组为不加唑来膦酸(0 mol·L－1)，空白组为只加培养液不加细胞，分别在37℃培养箱中孵育24、48、72 h后，向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液终止反应，37℃孵育2 h，测定波长450nm处OD值。

1.2.3 碱性磷酸酶检测 上述“1.2.1”实验收获的细胞采用低糖DMEM培养基调整细胞浓度109·L－1，取2 ml分别接种到放有盖玻片的6孔培养板，取2孔加入终浓度10－5mol·L－1唑来膦酸，对照组不加唑来膦酸(0 mol·L－1)，放入37℃，0.05 CO2培养箱培养，于72 h后取出细胞爬片，采用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒检测碱性磷酸酶。

1.2.4 唑来膦酸对OB RANKL/OPG mRNA表达影响检测

1.2.4.1 唑来膦酸处理培养的细胞 上述“1.2.1”实验收获的细胞采用低糖DMEM培养基悬浮，分6组，各实验组加入等体积不同浓度的唑来膦酸，混匀，使唑来膦酸终浓度分别为 10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol·L－1，对照组不加唑来膦酸(0 mol·L－1)，分别在 37℃培养箱中孵育 24、48、72 h后收获所有细胞悬液，离心，上清保存于－80℃低温冰箱，准备用ELISA检测sRANKL和OPG浓度，沉淀的细胞提取RNA。

1.2.4.2 总RNA提取与定量 沉淀的细胞用低糖DMEM培养液制成细胞悬液，加入1 ml TRIzol，用紫外分光光度计准确定量，测定结果OD260∶OD280＞1.8，根据A260nm计算RNA浓度，调整RT-PCR反应体系中RNA浓度。

1.2.4.3 引物 RANKL、OPG 和 GAPDH 引物序列根据GenBank的基因序列用引物设计软件Primer Premer设计，并由上海生物工程有限公司合成。RANKL(486 bp):上游引物:+5'GCCAGTGGGAGATGTTAG3'， 下 游 引 物:-5'TTAGCTGCAAGTTTTCCC3';OPG(324 bp):上游引物:+5'GCTAACCTCACCTTCGAG3'，下游引物:-5'TGATTGGACCTGGTTACC3';GAPDH(206 bp):上游引物:+5'GGAGTCAACGGATTTGGT3'，下游引物:－5'GTGATGGGATTTCCATTGAT3'。

1.2.4.4 逆转录及PCR扩增 按照试剂盒说明逆转录得cDNA，总RNA加样量均为1 μg。PCR反应条件分别为:RANKL:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃ 延伸1 min，35 个循环后72℃延长10 min。OPG:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30个循环后72℃延长10 min。同时以GAPDH的cDNA扩增产物作为内参照，扩增条件同各个目的基因。产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像自动分析仪下照相，并计算RANKL/GAPDH和OPG/GAPDH灰度比值。

1.2.5 培养上清检测sRANKL和OPG 唑来膦酸处理后的细胞培养液上清，ELISA法检测sRANKL和OPG浓度，方法按试剂盒说明书。

1.3 统计学处理 不同药物浓度处理组数据比较采用 SPSS11.5 for Windows中的 One-way ANOVA统计法分析;各种统计图采用SPSS11.5 for Windows及Microsoft Excel统计软件获得。

2 结果

2.1 唑来膦酸对OB增殖的影响 唑来膦酸使OB的CCK-8实验吸光值呈不同程度升高。大体上，唑来膦酸浓度越高，作用时间越长，吸光值升高越明显，但不呈线性关系。见Fig 1。

Fig 1 OD in OB CCK-8 assay(n=5)

2.2 唑来膦酸对OB碱性磷酸酶染色影响 与未经唑来膦酸处理的OB比较，加唑来膦酸10－5mol·L－1干预72 h后细胞数量明显增多，碱性磷酸酶染色阳性增加。见Fig 2。

Fig 2 OB alkaline phosphatase staining ×200，scale bar=50μm

2.3 唑来膦酸对MM OB RANKL/OPG mRNA表达的影响

2.3.1 唑来膦酸对MM OB RANKL mRNA表达影响 MM OB经唑来膦酸处理后，RT-PCR检测RANKL mRNA表达，结果见 Fig 3，4。用 ELISA检测OB培养上清液sRANKL浓度，结果见Fig 4。如Fig 3，4，唑来膦酸作用24和48 h后，OB RANKL mRNA表达变化不明显。作用72 h，低浓度(10－9mol·L－1)唑来膦酸显示能降低RANKL mRNA表达，与对照(0 mol·L－1)比较，差别有统计学意义(P＜0.05)。OB培养上清的sRANKL浓度也呈现类似的变化。

Fig 3 RANKL mRNA expression in OB after zoledronic acid treatment for 24，48 and 72 h

Fig 4 RANKL mRNA expression in OB and culture medium sRANKL concentration after zoledronic acid treatment for 24，48 and 72 h.

2.3.2 唑来膦酸对OB OPG mRNA表达影响 MM OB经唑来膦酸处理后，RT-PCR检测OPG mRNA表达，结果见Fig 5，6。用ELISA检测OB培养上清液OPG浓度，结果见Fig 6。唑来膦酸作用24 h后，OB OPG mRNA表达变化不明显。作用48 h，呈不同程度增加，以 10－8mol·L－1浓度最明显，与对照(0 mol·L－1)比较，差别有统计学意义(P＜0.05)。作用72 h，呈不同程度增加，以 10－7mol·L－1浓度最明显，与对照(0 mol·L－1)比较，差别有统计学意义(P＜0.05)。OB培养上清的OPG浓度也呈现类似的变化。

Fig 5 OPG mRNA expression in OB after zoledronic acid treatment for 24，48 and 72 h

3 讨论

MBD的机制是OC活性增强，OB活性减低。二膦酸盐是MBD的主要治疗药物，二膦酸盐是一类与内源性焦磷酸盐结构相似的化合物，与骨质中羟磷灰石呈高亲和力，能优先被转运到骨形成或吸收加速的部位，一旦沉积到骨表面，就会被具有破骨作用的OC摄取，其作用机制通过抑制OC活化和增生来抑制骨吸收，减少骨基质生长因子的释放或抑制癌细胞黏附于骨基质。MM的OB活性下降，新骨形成障碍受到广泛关注。目前还没有证据说明二膦酸盐能促进MM患者OB活性的恢复。为此，我们在MM患者的骨髓BMSCs诱导生成的OB加入唑来膦酸，研究其对OB增殖的影响。

我们采用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖变化，结果显示:唑来膦酸使OB的实验吸光值呈不同程度升高。大体上唑来膦酸浓度越高，作用时间越长，吸光值升高越明显，但不呈线性关系。通过OB碱性磷酸酶染色检测，也发现经过唑来膦酸处理的OB比对照组数目明显增多，碱性磷酸酶阳性率也升高。

Fig 6 OPG mRNA expression in OB and culture medium OPG concentration after zoledronic acid treatment for 24，48 and 72 h

Im等［2］曾报告，以人骨小梁取材细胞原代培养(体内)及MG-63 OB系(体外)作为研究对象，采用不同浓度二膦酸盐作用不同时间后，发现二膦酸盐比空白对照组能够明显增加细胞的数量。我们的研究结果与之相仿，提示二膦酸盐可能有促进MM患者OB活性恢复的作用。

唑来膦酸促进OB增殖的机制还不清楚。b-FGF和BMP-2被认为是一种潜在的骨传导和生长因子，参与间充质前体细胞募集﹑增殖及分化，最终导致骨组织的生成。Cbfa-1是runt家族的转录因子，在骨形成起到关键作用，它被认为是OB分化的关键性转录因子。Mundy等［3］认为二膦酸盐通过诱导BMP-2的表达刺激OB。von Knoch等［4］的实验表明双膦酸盐可能促进BMP-2和Cbfa-1等关键的成骨形成转录因子，通过作用一连串的增殖启动，从而导致BMSCs向OB的定型、分化和成熟。

RANKL/OPG是OC的重要调节因子，在MBD中RANKL mRNA表达上调，OPG mRNA表达下调，RANKL/OPG主要由OB产生。我们研究表明，唑来膦酸对RANKL mRNA表达的影响较小，24 h和48 h时各浓度组对RANKL表达都没有影响，72 h时10－9mol·L－1浓度组RANKL表达降低。唑来膦酸对OPG表达的影响较明显，作用48和72 h后，表达呈不同程度增加，作用48 h时以10－8mol·L－1浓度组增加最明显，作用72 h时以10－7mol·L－1浓度组增加最明显。

上述结果显示唑来膦酸可能下调OB RANKL mRNA表达，上调OB OPG mRNA表达，以后一种作用更为明显。我们注意到唑来膦酸的作用不是浓度依赖性，也不是时间依赖性，其可靠性可能受到质疑。不过我们同时检测培养上清中的RANKL/OPG浓度，其变化规律与OB mRNA的表达相吻合，支持唑来膦酸对RANKL/OPG mRNA表达起保护骨的作用。

［1］ Kadiyala S，Young R G，Thiede M A，Bruder S P.Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro［J］.Cell Transplant，1997，6(2):125－34.

［2］ Im GI，Qureshi SA，Kenney J，et al.Osteoblast proliferation and maturation by bisphosphonates［J］.Biomaterials，2004，25(18):4105－15.

［3］ Mundy G，Garrett R，Harris S，et al.Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins［J］.Science，1999，286(5446):1946－9.

［4］ Von Knoch F，Jaquiery C，Kowalsky M，et al.Effects of bisphosphonates on proliferation and osteoblast differentiation of human bone marrow stromal cells［J］.Biomaterials，2005，26(34):6941－9.