瑞香狼毒根提取物及不同溶剂萃取物对马铃薯腐烂茎线虫触杀活性研究

郭 霞, 丁文姣, 杨甲月, 徐 蕊, 燕志强, 秦 波,2*

(1.中国科学院兰州化学物理研究所/中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室,兰州 730000; 2.兰州大学功能有机分子化学国家重点实验室,兰州 730000)

瑞香狼毒(Stellera chamaejasme Linn.)为瑞香科狼毒属多年生草本植物,广泛分布于我国东北、华北、西南及西北等地区的草地及高山向阳处,资源十分丰富[1-3]。瑞香狼毒有毒,为家畜所不食,且在北方草地大肆蔓延,致使优良牧草逐年退化,造成草场逆行演替,使草地生态平衡遭受破坏,危害草地生态和畜牧业发展。因此,加强草原优势植物中活性物质基础研究及合理利用,对于防止草原退化和毒草蔓延具有重要意义[4]。

马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor T.)是一种常见的迁移性内寄生线虫,分布于欧、美、亚洲等地区,已报道的寄主植物有120多种[5-6]。马铃薯腐烂茎线虫对植物的危害不仅表现在掠夺寄主植物营养以及取食活动对植物根际造成损伤,更重要的是其食道腺分泌物会导致寄主植物发生一系列病理变化,以及刺激和促进其他病原物的继发性侵染危害[7]。马铃薯腐烂茎线虫是发生植物病害的一个重要诱因,可导致甘薯茎线虫病[8]、当归麻口病[9]等多种病害的发生,影响作物的产量和品质。

有研究表明,瑞香狼毒根的乙醇提取物对菜粉蝶幼虫、亚洲玉米螟幼虫和桃蚜等多种害虫有较强的生物活性[10],但对线虫的触杀活性尚未见有研究报道。本文以马铃薯腐烂茎线虫为活性试验模型,采用活体生物试验方法,针对瑞香狼毒根提取物对马铃薯腐烂茎线虫触杀活性有效部位进行了研究,对瑞香狼毒丰富的植物资源的合理利用、植物源杀线虫剂的研究和良性草地生态恢复奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试植物:瑞香狼毒(Stellera chamaejasme Linn.)植物根部,采自甘肃省岷县高山草甸。

供试线虫:马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor Thorne),分离自河北省保定市甘薯田发生甘薯茎线虫病的薯块。

1.2 试验方法

1.2.1 线虫的分离

根据文献报道[11],将采集到的受马铃薯腐烂茎线虫危害的甘薯块用自来水冲洗干净,剖开病薯,切成薄片,用镊子撕成小块,采用贝曼漏斗分离法提取虫体,待自然沉降后,用竹丝挑出,冲洗,收集。将分离得到的线虫用无菌水洗出,冲入无菌指形管中,用0.5%的次氯酸钠消毒2 min,用无菌水冲洗3遍,定容到一定体积放置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 线虫的培养

在PDA平板(约22 mL)中接入茄病镰刀菌(Fusarium solani),于25℃温箱中暗培养。待菌丝长满整个培养皿后,在培养基中央刻一小口,加入消毒过的马铃薯腐烂茎线虫约500条。将培养皿用封口膜(parafilm)包好,正置放入25℃温箱中黑暗培养,接种培养2～3 d后将培养皿皿盖朝下放置,继续培养35～40 d左右,取培养皿皿盖上的线虫供测定用。

1.2.3 瑞香狼毒根提取物的制备

对供试植物根干燥样品进行粉碎,将瑞香狼毒根粗粉500 g置于底口瓶内,95%乙醇中浸泡过夜,以渗漉法提取,渗漉液减压浓缩,得乙醇浸膏。乙醇浸膏以30%乙醇-水液混悬,分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯于室温下连续萃取5次,合并萃取液,减压浓缩,依次制得瑞香狼毒根的石油醚、氯仿、乙酸乙酯及水相萃取浸膏。于50℃下减压干燥,分别制得乙醇提取物及不同极性部位萃取物,待试验用。

1.2.4 触杀活性测定

采用提取物的二甲基亚砜(DMSO)溶液与虫样液共混直接触杀法进行试验[7]。精确称取瑞香狼毒根乙醇提取物及石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水相萃取物减压干燥样品,分别溶于DMSO中制成样品母液。试验时以适量DMSO释成浓度为0.02 g/mL的试液进行触杀活性测定。具体方法为:先将相同体积(V1)的线虫悬浮液分别注入24孔细胞培养板的样品孔内,再根据试验浓度(N)需要,补充一定体积(V2)的无菌水,最后加入相应量的药剂母液(V3),混合均匀,置于温度为25℃、湿度为80%～90%的培养箱中,每处理设3组重复,每重复50～100条线虫,分别以加入相应浓度的DMSO和无菌水作为对照。处理后24、48、72 h分别记录各处理组线虫的死亡与存活情况。计算公式如下[12]:

每孔溶液的总体积(V)=线虫悬浮液体积(V1)+

补充无菌水体积(V2)+药剂母液体积(V3);

式中:每孔溶液的总体积(V)=线虫悬浮液体积(V1)+补充无菌水体积(V2)+药剂母液体积(V3),试验浓度(N)事先设定,线虫悬浮液体积(V1)固定不变(100μL),药剂母液浓度(N0)已知,因此,在总体积(V)固定的情况下(400μL),就可以得出不同处理的无菌水体积(V2)及药剂母液体积(V3)[12]。

1.3 数据处理

采用Excel 2007和DPS 3.1软件对试验数据进行整理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 狼毒提取物对马铃薯腐烂茎线虫室内触杀活性测定结果

瑞香狼毒根提取物及不同极性萃取物对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性试验结果见表1、图1。

由表1和图 1可以看出,处理后24、48、72 h,狼毒根乙醇提取物对马铃薯腐烂茎线虫均表现出明显的触杀活性,并且石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水相萃取物在不同浓度下对马铃薯腐烂茎线虫表现出的触杀活性也不同。药剂处理后24 h,乙醇提取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物处理的线虫校正死亡率均达到了60%以上,三者之间无显著差异。其中,乙酸乙酯萃取物对马铃薯腐烂茎线虫的活性最强,校正死亡率达69.49%,与石油醚萃取物之间有显著差异(p＜0.05),与水相萃取物之间存在极显著性差异(p＜0.01)。药剂处理48 h后,各处理组的线虫死亡率继续增加,乙醇提取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物处理的线虫校正死亡率达到了70%以上,均与水相萃取物之间存在极显著差异(p＜0.01)。其中,乙酸乙酯萃取物对马铃薯腐烂茎线虫的触杀率达80.58%。药剂处理72 h后,乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物处理的线虫校正死亡率达到了80%以上。其中,乙酸乙酯萃取物处理的线虫校正死亡率达86.88%,其与石油醚萃取物和水相萃取物之间均存在极显著差异(p＜0.01)。由此可以看出,乙酸乙酯萃取物对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性最强,其次为氯仿萃取物、石油醚萃取物、水相萃取物(图1)。

表1 瑞香狼毒不同根提取物及不同溶剂萃取物对马铃薯腐烂茎线虫室内触杀活性测定

图1 不同时间瑞香狼毒根提取物对马铃薯腐烂茎线虫的室内活性比较

2.2 瑞香狼毒根提取物对马铃薯腐烂茎线虫的毒力比较与线性分析

为了进一步对供试乙醇提取物和各溶剂萃取物进行活性筛选和比较,对各提取物进行了系统毒力测定。根据预试验,将供试各提取物用 DMSO溶解,配制成浓度为0.1 g/mL的样品母液,试验时再将母液稀释为 1%、2%、3%、5%、7%、10%、15%、20%8个试验浓度,对马铃薯腐烂茎线虫的毒力测定结果如表2所示。

瑞香狼毒根提取物与不同溶剂萃取物对马铃薯腐烂茎线虫触杀毒性作用的线性分析结果见表2,处理后不同时间,由瑞香狼毒根乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物的回归方程可以看出,乙酸乙酯萃取物的作用强度基本与乙醇总提取物的作用趋势一致,两者的毒力分析都具有良好的量效关系,并且不同萃取物对马铃薯腐烂茎线虫的毒力与其触杀活性呈现出一致的趋势,LC50由小到大顺序依次为:乙酸乙酯萃取物＜氯仿萃取物＜石油醚萃取物＜水萃取物。由此可见,乙酸乙酯萃取物是瑞香狼毒线虫触杀活性的有效成分,随着提取物中活性化学成分含量的增加,对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性增强。

表2 瑞香狼毒根的不同提取物对马铃薯腐烂茎线虫的毒力测定

3 讨论

我国地跨温、热两带,植物种类繁多,作物复种指数高,沙暖性土壤比例大,适于线虫繁殖危害,线虫病对我国农业生产造成的损失高于世界平均水平,且危害日趋严重[13]。长期以来,植物线虫病的防治主要依赖化学防治,目前所用杀线虫剂多属高毒农药[14],在环境保护及农产品残毒等方面的压力下,这些药剂将逐渐遭禁止。植物源杀线虫剂由于其性能优异,不易使线虫产生抗药性,以及良好的环境相容性,引起了世界范围内许多国家的重视。从自然界植物中寻找环境友好天然杀线虫活性物质的研究,已成为化学和生物学研究领域的一大热点[15]。

据记载,狼毒有良好的杀虫效能,我国民间就有将其细粉用于植物病虫害防治的实践经验,将瑞香狼毒根晒干研成细粉,翻地时放入沟内,可杀死地下害虫[16]。本文以对农业生产危害严重的马铃薯腐烂茎线虫作为室内活性试验模型,测试并比较了瑞香狼毒根乙醇提取物及石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水萃取物对马铃薯腐烂茎线虫的室内触杀活性,并且进行了毒力比较。首次报道了瑞香狼毒根乙醇提取物对马铃薯腐烂茎线虫有较强触杀活性,乙酸乙酯萃取部位的作用强度基本与乙醇总提取物的作用趋势一致,而且两者的毒力分析都具有良好的量效关系,由此可见,乙酸乙酯萃取部位是瑞香狼毒线虫触杀活性的有效部位,随着提取物中活性化学成分含量的增加,对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性增强,为线虫触杀活性化学物质研究以及植物源杀线虫剂的研究奠定了基础,同时也为瑞香狼毒的资源利用和草地生态建设提供了依据。

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