藏药蕨麻多糖的光谱性质及单糖组成分析

夏 莲，孙志伟，李国梁，索有瑞，尤进茂，2*

1中国科学院西北高原生物研究所，西宁810001;2山东省曲阜师范大学化学与化工学院生命有机分析重点实验室，曲阜273165;3中国科学院研究生院，北京1000491

藏药蕨麻多糖的光谱性质及单糖组成分析

夏 莲1，2，3，孙志伟1，3，李国梁1，3，索有瑞1，尤进茂1，2*

1中国科学院西北高原生物研究所，西宁810001;2山东省曲阜师范大学化学与化工学院生命有机分析重点实验室，曲阜273165;3中国科学院研究生院，北京1000491

本研究对藏药蕨麻多糖进行了分离提纯，并测定其水溶性多糖含量为99.4%;通过紫外光谱与红外光谱分析表明，蕨麻多糖为分子量较小的α-吡喃糖，并含有氨基糖;蕨麻多糖的水解单糖经过NMP衍生后进行毛细管电泳分析，测得其单糖组成为木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，含量分别为3.945、77.445、17.568、17.646、3.942、2.165、65.268、13.037 μg/mg和33.484 μg/mg，与GC-MS的定性分析结果一致。

蕨麻;多糖;光谱性质;单糖组成

蕨麻(Potentilla anserine L.)为蔷薇科委陵菜属植物鹅绒委陵菜的根，为藏医常用药，又名戳玛、卓老洒曾、延寿果、人参果、仙人果等。蕨麻分布很广，但据《新华本草纲要》记载“只在青藏高原，本种始有块根发育”［1］。本药具有应用历史悠久、民族药特征明显等特点，深受藏族同胞的喜爱，是当地人的“常用上药”［2］。现代药理学表明:蕨麻具有健脾胃、收敛止血、补血益气、生津利痰之功效，主治脾虚腹泻、贫血及营养不良等症［3］，另有报道蕨麻具有治疗黄疸性及病毒性肝炎的功效［4，5］。据文献记载，蕨麻中含有糅质、糖类、蛋白质、脂肪酸及委陵菜苷等成分［6-9］，但对蕨麻多糖的研究还仅限于总糖含量的测定［10，11］。

研究表明，多糖类物质不仅具能够提高免疫系统功能，而且具有较高的抗癌等生物活性［12，13］。不同植物中提取的多糖其生物活性也有很大差别，主要取决于多糖的单糖组成，分子量以及链构象［14］。因此，对多糖的单糖组成分析具有重要意义。本研究利用紫外光谱、红外光谱、毛细管电泳以及气相色谱-质谱联用等方法对蕨麻多糖的单糖组成进行了研究，为进一步开发利用藏药蕨麻提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂及主要仪器

蕨麻植物样品8月份采自青海玉树地区，经中国科学院西北高原生物研究所藏药中心周昌范研究员鉴定。

1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)由本实验室合成［15］;单糖标准品(sigma公司，美国);硼砂(分析纯，徐州试剂二厂);水为Milli-Q超纯水;其它试剂均为分析纯。

CARY 300紫外可见光度计(Varian公司)，Nicolet 10DX-FTIR红外光谱仪。HP6890和HP5973气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)，HP-3D毛细管电泳仪(美国，Agilent公司)，配备二极管阵列检测器;毛细管，总长58.5 cm，有效长度50 cm，内径50 μm(河北省永年锐沣色谱器件有限公司)

1.2 实验方法

1.2.1 蕨麻多糖的提取、分离纯化及水解

干燥、研细的蕨麻根块100 g，加100 mL乙醇和乙醚(体积比1∶1)混合液，65℃水浴回流3 h去脂，抽滤，沉淀物溶于100 mL 85%的乙醇，超声波提取30 min去单糖，抽滤，沉淀物加水溶解后超声波提取90 min，抽滤，旋转蒸发滤液，得60 mL粘稠液，补加3倍体积95%的乙醇，静止放置24 h，离心，沉淀物加水溶解后用氯仿-正丁醇(体积比4∶1)萃取三次(脱蛋白);上清液继续补加95%乙醇至乙醇浓度为90%，放置24 h，离心沉淀，沉淀物于70℃烘干，得蕨麻粗多糖。

取蕨麻粗多糖10 mg于安培瓶中，加3 mol/L的三氟乙酸2 mL溶解后封口，于110℃下水解10 h，放冷后N2吹干。

1.2.2 总糖含量的测定

精密量取1 mg/mL的葡萄糖对照品溶液0.05，0.25，0.75，1.0，1.25 mL，分别置于10 mL具塞试管中，加水稀释至10 mL。准确加入5%的苯酚溶液1 mL，混匀，冰水浴，再精密加入浓硫酸5 mL后98℃水浴加热20 min，自来水水浴冷却5 min，室温放置10 min，以空白溶液为对照于488 nm处测吸光度。以吸光度(A)对葡萄糖检测浓度(C)进行线性回归。

吸取10 μg/mL的样品液1 mL，测定吸光度，多次测量取平均值，通过回归方程求得相应糖浓度值，计算总糖含量。

1.2.3 蕨麻多糖紫外-可见光谱与红外光谱分析

制备0.1 mg/mL-1蕨麻多糖水溶液，在400～190 nm范围内扫描;蕨麻多糖以溴化钾压片，在波数4000～400 cm-1范围内进行红外光谱扫描。

1.2.4 蕨麻多糖水解单糖的毛细管电泳分析

NMP的标记过程:向2 mL安瓿瓶中加入200 μL(0.05 M)NMP乙腈溶液、20 μL单糖标准品混合液(0.01 M)、20 μL 17%氨水，封口后于70℃水浴中反应35 min，取出放冷后用氮气吹干，加2 mL乙腈-水(体积比为4∶1)溶解后进样分析。

毛细管电泳条件:采用58.5 cm×50 μm id毛细管(有效柱长50 cm)，55 mmol/L硼酸盐缓冲溶液(pH 9.46)，柱温20℃，分离电压22 kV，进样10 s，不加任何添加剂。

1.2.5 蕨麻多糖水解单糖的气相色谱-质谱分析

乙酰化过程:取10 mg蕨麻多糖经水解后，加入盐酸羟胺5.0 mg，吡啶100 μL，振荡混匀，放入90℃水浴中加热反应30 min。取出后冷却至室温，加100 μL醋酸酐，90℃下继续反应30 min进行乙酰化，冷却至室温，70℃水浴中将反应产物用N2吹干，加入800 μL氯仿重新溶解，取1 μL进行GC-MS分析。

气相色谱分析条件:载气为高纯氦气;进样口温度280℃;程序升温，起始温度100℃，以10℃/min升至170℃，再以5℃/min升至260℃，保持5 min;载气流速1.2 mL/min，分流比20∶1;EI离子源，电子能量70 eV;质荷比扫描范围55～550，离子源温度230℃，接口温度280℃。

2 结果与讨论

2.1 蕨麻多糖的提取率及总糖含量

蕨麻块根经去脂、去单糖后，利用水提醇沉法提取粗多糖，经savage法除蛋，得多糖252.0 mg。

以吸光度(A)对葡萄糖检测浓度(C)进行线性回归，得回归方程为 C=0.2137A-0.0159(r= 0.9994)。结果表明，葡萄糖检测浓度在22.31～114.03 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。由回归方程计算得蕨麻多糖水溶性多糖的含量为98.4%

2.2 蕨麻多糖紫外-可见光谱分析

紫外光谱图中，195 nm处显示多糖的特征吸收，在260 nm和280 nm处无蛋白、核酸吸收峰［16］，表明多糖中无蛋白、多肽及核酸的存在。

2.3 蕨麻多糖的红外光谱分析

图1 蕨麻多糖的红外光谱图Fig.1 The IR spectrum of polysaccharide from Potentilla anserine L.

蕨麻多糖经红外光谱分析如图1，在3600～3200、3200～2800、1400～1200 cm-1和1200～1000 cm-1，这4个谱段内都出现了典型多糖物质的吸收峰，分别为O-H键和分子内或分子间氢键的伸缩震动，C-H键的伸缩震动，C-H变角震动，C-O-H和吡喃环的C-O-C两种C-O键形成的伸缩震动，1630 cm-1附近的吸收峰为酰胺基团中乙酰基的特征吸收，表明蕨麻多糖中有氨基糖的存在;在845.45 cm-1处的吸收为α-吡喃型糖的的特征吸收，而890 cm-1附近无吸收，说明蕨麻多糖成苷的半缩醛羟基主要为α构型的吡喃糖，而没有β构型;2921 cm-1处的吸收峰不明显，提示其分子结构中甲基和亚甲基含量比较小［17］，体现为分子链较短，相对分子量较小。

2.4 蕨麻多糖水解单糖的毛细管电泳分析

单糖缺乏常规的紫外生色基团，所以单糖的衍生化是获得高灵敏紫外检测的必要步骤。Suzuki等［18］以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为衍生试剂，利用活泼碳(C-4)和还原糖的还原端之间的缩合反应进行糖类的测定。本文以本课题组合成的1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)作柱前衍生剂，实现了蕨麻多糖水解单糖在毛细管区带电泳模式下的分离和定量，为蕨麻多糖的应用开发提供了可靠理论依据。单糖衍生反应过程见图2(以甘露糖为代表单糖)。

图21 -(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)与还原性单糖衍生反应示意图Fig.2 Derivatization scheme of 1-(2-naphthyl)-3-methyl-5-pyrazolone(NMP)with reductive saccharides

NMP标记的糖类衍生物在250～5 μmol/L范围内，依据峰面积对单糖浓度进行线性回归，所得各单糖衍生物的线性回归方程、相关系数和检出限见表1。

表1 单糖衍生物的线性回归方程、相关系数、检测限及保留时间和峰面积的重现性(n=6)Table 1 Linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and repeatabilities for peak area and retention time of saccharide derivatives(n=6)

*Y:峰面积(peak Area)，X:单糖浓度(concentration of monosaccharide)，μmol/L.

蕨麻多糖水解单糖按上述方法衍生后进样分析，电泳分离见图3。用线性回归方程定量，经多次测量得单糖含量见图4。图中峰1、峰2、峰3为未知成分，推测为氨基糖。

图3 蕨麻多糖水解单糖的毛细管区带电泳分离图Fig.3 Chromatograms of saccharides from Potentilla anserine L.sample by capillary zone electrophoresis

图4 蕨麻多糖中各单糖含量Fig.4 Quantitative of saccharides separated from Potentilla anserine L.

2.5 蕨麻多糖水解单糖的气相色谱-质谱分析

图5 蕨麻多糖水解单糖乙酰化衍生物的总离子流图Fig.5 Total ion chromatogram of acetylated derivatives of saccharides from Potentilla anserine L.sample

蕨麻多糖水解单糖经乙酰化后，用GC-MS分析其单糖组成，总粒子流图见图5。结果显示:蕨麻多糖的组成单糖主要为鼠李糖(1，Rha)、岩藻糖(2，Fuc)、阿拉伯糖(3，Ara)、木糖(4，Xyl)、甘露糖(5，Man)、葡萄糖(6，Glc)和半乳糖(7，Gal)，与毛细管电泳分析结果一致。由于糖醛酸容易发生内酯化，直接乙酰化衍生非常困难［19］，因此蕨麻多糖水解单糖的GC-MS分析，两种糖醛酸未能检测到。

3 结论

蕨麻多糖经提取、分离纯化后，进行总糖含量的测定，结果显示，蕨麻多糖总糖含量为98.4%;紫外光谱分析表明，在195 nm有多糖的特征吸收，而没有蛋白、多肽及核酸存在;红外光谱分析结果显示，845.45、1630 cm-1附近的吸收分别为α-吡喃型糖的的特征吸收和酰胺基团中乙酰基的特征吸收，且甲基、的特征吸收2921 cm-1不明显，因此，蕨麻多糖为分子量较小的α-吡喃糖，并含有氨基糖。毛细管电泳分析显示，蕨麻多糖的单糖组成主要是木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，含量分别为3.945、77.445、17.568、17.646、3.942、2.165、65.268、13.037 μg/ mg和33.484 μg/mg，与GC-MS的定性分析结果一致。本文对藏药多糖的单糖组成的定性定量分析为蕨麻在食品、医药和保健方面的开发应用提供可靠的科学依据。

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Spectral Properties and Monosaccharides Compositon Analysis of Polysaccharide from Potentilla anserina L.

XIA Lian1，2，3，SUN Zhi-wei1，3，LI Guo-liang1，3，SUO You-rui1，YOU Jin-mao1，2*1Key Laboratory of Life-Organic Analysis of Shandong Province，College of Chemistry Science，Qufu Normal University，Qufu 273165，China;2Northwest Plateau Institute of Biology，the Chinese Academy of Sciences，Xining 810001，China;3Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing，100049，China

The polysaccharide of Potentilla anserine L.was extracted and purified，and its contents was determined as 98.4%by phenyl-sulfuric acid method.The polysaccharide was identified by IR spectrum and UV scanning spectrum.The IR spectrum indicates that the characteristic absorption peaks at 3600-3200，3200-2800，1400-1200，1200-1000 cm-1，and 845 cm-1belonged the characteristic peak of α-pyranose.In addition，the peak at 1630 cm-1assigned to the C=O of acetamide moiety stretching vibration meant that amino sugars exited in the polysaccharide.A method was developed for the separation of derivatized carbohydrates of Potentilla anserine L.using 1-naphthyl-3-methyl-5-pyrazolone(NMP)as derivatization reagent by capillary zone electrophoresis，and the results shows that the monosaccharides compositions of the polysaccharide from Potentilla anserine L.are xylose，arabinose，glucose，rhamnose，mannose，fucose，galactose，glucuronic acid and galacturonic acid with contents of 3.945，77.445，17.568，17.646，3.942，2.165，65.268，13.037 μg/ mg，and 33.484 μg/mg，respectively，which are consistent with the results carried out by GC-MS.

Potentilla anserine L.;polysaccharide;spectral properties;monosaccharide composition

1001-6880(2011)03-0453-05

2009-10-15 接受日期:2010-06-12

国家自然科学基金(20075016);中国科学院“百人计划”项目(328)

*通讯作者 E-mail:jmyou6304@163.com

R284.2

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