白细胞介素21及白细胞介素12单用或联合应用对子宫内膜癌患者外周血单核细胞抗肿瘤活性的影响

田永菊，崔保霞，马道新，张 妍,3，侯 菲，张文静

山东大学 齐鲁医院 1妇产科 2血液病研究室，济南 2500123山东省潍坊市人民医院妇产科，山东潍坊 261041

·论著·

白细胞介素21及白细胞介素12单用或联合应用对子宫内膜癌
患者外周血单核细胞抗肿瘤活性的影响

田永菊1，崔保霞1，马道新2，张 妍1,3，侯 菲1，张文静1

山东大学 齐鲁医院1妇产科2血液病研究室，济南 250012
3山东省潍坊市人民医院妇产科，山东潍坊 261041

目的观察白细胞介素(IL)21及IL12单用或联合应用对子宫内膜癌患者外周血单核细胞(PBMCs)抗肿瘤活性的影响。方法体外分离子宫内膜癌患者外周血中的PBMCs，用低浓度IL2维持培养，经不同的刺激条件(对照组、抗IL21组、IL21组、IL12组和IL21+IL12联合组)诱导培养72 h后，采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测PBMCs 的细胞毒活性，流式细胞术检测CD4+CD25+FOXP3+T调节性细胞(Treg细胞)和CD4+IL17A+T辅助17细胞(Th17细胞)的含量，细胞活性检测试剂-8(CCK-8)法检测PBMCs的增殖能力，流式细胞术检测PBMCs的凋亡情况。结果与对照组相比，IL21及IL12可显著增强PBMCs细胞毒活性，IL21+IL12联合组的效果优于单用IL21组和IL12组。IL21及IL12可显著降低Treg细胞含量，抑制PBMCs凋亡。不同细胞因子处理组对Th17细胞的含量和PBMCs的增殖能力均无显著影响。结论IL21及IL12可增强子宫内膜癌患者PBMCs的细胞毒活性，联合应用效果更明显。抑制Treg细胞的分化和PBMCs的凋亡可能为其机制之一，而与Th17细胞的分化无关。

细胞因子；外周血单核细胞；细胞毒活性；Treg细胞；Th17细胞

在肿瘤形成过程中，肿瘤细胞可通过多种途径逃离免疫细胞的清除，包括自然杀伤(natural killer，NK)细胞和CD8+T细胞的功能丧失、Treg细胞的免疫抑制等[1-2]。近来研究发现，机体存在两种不同于传统Th1和Th2细胞的CD4+T细胞—Treg和Th17细胞。Treg细胞是一群免疫抑制性T细胞，可维持机体的自身免疫耐受，为肿瘤的发生发展提供逃逸免疫攻击的优势环境[3]。研究证实，多种恶性肿瘤外周血和肿瘤组织中Treg细胞数量增多[4-5]。Th17细胞主要分泌白细胞介素(interleukin，IL)17A、IL17F和IL6，可介导炎症反应，参与多种自身免疫性疾病和移植物抗宿主等疾病的发病过程，但Th17细胞在肿瘤免疫应答中的表达及其所起的作用仍有很多争议[6-7]。有研究显示，IL21和IL12在多种恶性肿瘤中发挥了强有力的抗肿瘤作用[8-10]，但二者对子宫内膜癌患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的抗肿瘤活性作用却鲜见报道。本研究在体外分离了子宫内膜癌患者的PBMCs， 观察了IL21及IL12单用或联合应用对子宫内膜癌患者PBMCs抗肿瘤活性的影响，并初步探讨了其机制，以期在临床上为子宫内膜癌患者制订出更有效的免疫治疗方案提供理论依据。

材料和方法

试剂和仪器人重组细胞因子IL2、IL21、IL12和兔抗人IL21抗体(美国Peprotech公司)，RPMI 1640培养液(美国Thermo公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，上海Fumeng Gene公司)，青链霉素混合液(100×，北京Solarbio Science & Technology公司)，淋巴细胞分离液(Ficoll，相对密度1.077，天津TBD公司)，人Treg细胞抗体(FITC- CD4、APC- CD25、PE- FOXP3)、人Th17细胞抗体(PE-Cy5- CD3、FITC- CD8、PE- IL17A)(美国eBioscience公司)，乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristic acetate, PMA)、离子霉素及莫能霉素(美国Alexis公司)，细胞活性检测试剂-8(cell counting kit-8, CCK-8)(南京凯基公司)，Annexin V-FITC Kit(美国Invitrogen公司)，LDH Cytotoxicity Kit (美国BioVision公司)。Iishikawa细胞株由本实验室常规保存。酶标仪(BIO-RAD, Model 680)、流式细胞仪(FACSCalibur)购自美国BD公司。

标本来源收集2010年3月至7月在山东大学齐鲁医院就诊的子宫内膜癌患者外周血标本14例，经病理组织学明确诊断，其中，腺癌Ⅰa期6例，Ⅰb期4例，Ⅰc期1例，Ⅱa期1例，Ⅲ期1例，透明细胞癌Ⅳ期1例，实验进行前患者未行任何抗肿瘤治疗。患者平均年龄为(57.5±6.0)岁(44～66岁)，近期内均无急慢性感染，无人类免疫缺陷病毒感染，无梅毒及病毒性肝炎，无自身免疫性疾病等病史。

Ishikawa细胞培养培养液为RPMI 1640，含10%FBS、100×青霉素和链霉素混合液，37℃、5%CO2培养箱中传代培养。收集对数生长期、生长状态良好的细胞进行实验。

PBMCs的分离和培养将子宫内膜癌患者外周血用Ficoll密度梯度离心法分离得到PBMCs，1%台盼蓝染色检测细胞活力(>95%)并计数。将细胞悬浮于RPMI 1640培养液(含20%FBS、100×青链霉素混合液和5 ng/ml IL2)，分5组培养，包括：对照组、抗IL21 (2 μg/ml)组、IL21 (50 ng/ml)组、IL12(5 ng/ml)组和联合组[IL21(50 ng/ml)+IL12(5 ng/ml)]。将5组细胞分别接种于6孔板(5×106个细胞/孔，用于细胞表型和细胞毒性检测)和96孔板(1×104个细胞/孔，设3个复孔，用于增殖检测)中，37℃、5% CO2培养箱中培养72 h后，用于下述实验。

乳酸脱氢酶释放法检测PBMCs的细胞毒活性效应细胞为5组经细胞因子处理72 h的PBMCs，靶细胞为Ishikawa细胞，效靶比为100∶1，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)释放法检测细胞毒活性。具体步骤参照LDH Cytotoxicity Kit说明书。用酶标仪以490nm波长测定各孔A值,按以下公式计算细胞毒活性：细胞毒活性(%)=(效靶细胞混合释放组A值-低释放组A值)/(最大释放组A值-低释放组A值)×100%

流式细胞术检测Treg细胞和Th17细胞培养的PBMCs经细胞因子处理72h后，每组收集1×106个细胞，充分洗涤、重悬，Treg细胞染色时首先用相应抗体进行细胞膜表型染色，然后用Fix/Perm固定和破膜，最后进行胞内抗体染色。Th17细胞染色时先用25 ng/ml乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristic acetate，PMA)、1 μg/ml离子霉素和1.7 μg/ml莫能霉素，37℃、5%CO2培养箱中培养4.5 h，其他步骤同上。用流式细胞仪检测，FCS Express V3软件分析数据。

CCK-8法检测PBMCs的增殖96孔板中的5组PBMCs经细胞因子处理72 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，同时设置空白对照组，每组3个复孔，37℃、5% CO2培养箱中培养4 h，用酶标仪以450 nm波长检测各孔A值。A值反映细胞增殖程度。

流式细胞术分析PBMCs的凋亡从凋亡早期分析细胞凋亡。收集5组经细胞因子处理72 h的PBMCs约1×105个，进行细胞凋亡检测，具体步骤参照Annexin V-FITC Kit说明书。用流式细胞仪检测，FCS Express V3软件分析数据。

结 果

细胞因子处理后PBMCs细胞毒活性的比较IL21组[(64.50±7.08)%]、IL12组[(49.35±3.40)%]和IL21+IL12联合组[(74.27±3.46)%]PBMCs对Ishikawa细胞的细胞毒活性明显高于对照组[(43.89±3.73)%](P均<0.01)。使用抗IL21抗体[(40.21±3.62)%]中和IL21的生物活性后，PBMCs细胞毒活性明显下降(P<0.05)。IL21+IL12联合组PBMCs细胞毒活性均明显高于IL21组和IL12组(P均<0.01)。

Treg细胞和Th17细胞的检测结果与对照组[(5.86±1.04)%]相比，IL21组[(3.96±0.50)%]、IL12组[(3.98±0.60)%]和IL21+IL12联合组[(3.83±0.59)%]Treg细胞的含量均显著降低(P均<0.01)。使用抗IL21[(7.16±1.26)%] 中和IL21的生物活性后，Treg细胞的含量显著升高(P<0.05)。IL21+IL12联合组与IL21组和IL12组相比，Treg细胞的含量差异均无统计学意义(P均>0.05)(图 1)。

对照组、抗IL21组、IL21组、IL12组和IL21+IL12联合组的Th17细胞含量分别为(0.31±0.16)%、(0.25±0.12)%、(0.39±0.30)%、(0.17±0.07)%和(0.21±0.08)%，与对照组相比，各细胞因子处理组对Th17细胞的含量均无显著影响(P均>0.05)(图 2)。

细胞因子处理后PBMCs增殖能力的比较与对照组相比，抗IL21组、IL21组、IL12组和IL21+IL12联合组对PBMCs的增殖能力均无显著影响；IL21+IL12联合组分别与IL21组和IL12组相比，差异亦无统计学意义(P均>0.05)。

细胞因子处理后PBMCs凋亡情况的分析PBMCs诱导培养72 h后，IL21组[(7.80±0.36)%]、IL12组[(8.05±1.08)%] (P均<0.01)和IL21+IL12联合组[(7.41±1.29)%] (P<0.05)凋亡率均较对照组[(11.13±1.33)%]明显下降。使用抗IL21抗体[(13.94±1.55)%] 中和IL21的生物活性后，PBMCs凋亡率明显上升(P<0.05)。IL21+IL12联合组分别与IL21组和IL12组比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)(图 3)。

讨 论

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，在传统的三大治疗措施手术、化疗和放疗的基础上，其治疗综合水平日益提高，但从总体上，子宫内膜癌术后转移、 复发仍是一个亟待解决的难题。近年研究发现，Treg细胞在肿瘤患者的外周血及肿瘤组织中均增多，并以独特的免疫抑制作用影响机体的抗肿瘤免疫应答。降低Treg细胞的数量，可打破机体的免疫耐受状态，增强机体的抗肿瘤免疫应答。Th17细胞可特异性地分泌IL17，介导炎症反应，参与自身免疫性疾病和移植物抗宿主等疾病的发生发展，但其在肿瘤发生发展中的作用仍有很多争议。近年来，生物治疗中的细胞因子免疫治疗因其影响肿瘤的发生发展，受到越来越多的关注。目前 IL21和IL12等正在进行临床试验，但其是否影响子宫内膜癌患者PBMCs的抗肿瘤活性尚不明确。

A～E图右上限为Treg细胞，各象限内的百分数代表Treg细胞的含量，此流式图为14例子宫内膜癌患者中1例的实验结果，具有代表性The upper-right quadrant of A-E group represents Treg cells and the numbers with the dot plots represent the percentages of Treg cells, this chart reflects a typical case among these 14 patients with endometrial cancerA.对照组；B.抗IL21组；C.IL21组；D.IL12组；E. IL21+IL12联合组 A.control group; B.anti-IL21 group; C.IL21 group; D: IL12 group; E: combined group

A～E图左上限为Th17细胞，各象限内的百分数代表Th17细胞的含量，此流式图为14例子宫内膜癌患者中1例的实验结果，具有代表性The upper-left quadrant of A-E group represents Th17 cells and the numbers with the dot plots represent the percentages of Th17 cells, this chart reflects a typical case among these 14 patients with endometrial cancerA.对照组；B.抗IL21组；C.IL21组；D.IL12组；E.IL21+IL12联合组 A.control group; B: anti-IL21 group; C.IL21 group; D.IL12 group; E.combined group

A～E图右下限为凋亡细胞，各象限内的百分数代表凋亡细胞的含量，此流式图为14例子宫内膜癌患者中1例的实验结果，具有代表性The lower-right quadrant of A-E group represents the apoptotic cells and the numbers with the dot plots represent the percentages of apoptosis cells, this chart reflects a typical case among these 14 patients with endometrial cancerA.对照组；B.抗IL21组；C.IL21组；D.IL12组；E.IL21+IL12联合组 A.control group; B: anti-IL21 group; C.IL21 group; D.IL12 group; E.combined group

IL21是一种新型免疫刺激因子，能增强NK细胞和CD8+T细胞的细胞毒活性，抑制Treg细胞的免疫抑制作用等[11-13]。此外，IL21可上调抗凋亡因子Bcl-2的表达，是静息和活化T细胞的生存因子[14]。目前IL21已在肾细胞癌、恶性黑色素瘤和非霍奇金淋巴瘤等患者中进行了Ⅰ期和Ⅱ期临床试验[10]，表现出了有效的抗肿瘤效能和安全性。本研究发现子宫内膜癌患者PBMCs在低浓度IL2维持培养下细胞毒活性很低，使用抗IL21抗体中和培养体系中IL21的生物活性后，细胞毒活性显著降低。当加入IL21后，细胞毒活性显著增强，进一步研究发现Treg细胞数量显著减少，PBMCs的凋亡显著受抑制。Monteleone等[15]研究认为，L21可与转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)一起诱导Th17细胞的分化。本研究中，子宫内膜癌PBMCs经低浓度IL2维持培养和IL21诱导培养72h后，Th17细胞的含量无明显增加，说明IL21增强PBMCs的抗肿瘤作用可能与Th17细胞无关。

IL12是一种具有多种生物活性的免疫调节因子，可增强NK细胞和CD8+T细胞的细胞毒活性，诱导干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等分泌[16]，并通过诱导IFN-γ的分泌和抑制IL2的表达来抑制Treg的增殖和活性[17]。目前IL12已在卵巢癌、宫颈癌、原发性腹膜癌、恶性黑色素瘤等患者中进行了Ⅰ期和Ⅱ期临床试验，其显著的抗肿瘤作用引起广泛关注。本研究发现，IL12能增强PBMCs的细胞毒活性，可能机制为降低Treg细胞的数量和抑制PBMCs的凋亡，从而诱导PBMCs的抗肿瘤活性。虽然有研究表明IL12可抑制小鼠脾淋巴细胞向Th17细胞分化[18]，但在本研究中，子宫内膜癌患者PBMCs经IL12诱导培养后，Th17细胞的含量无明显下降，提示IL12增强PBMCs的抗肿瘤作用可能与Th17细胞无关。

恶性肿瘤具有多种逃避肿瘤治疗的机制，为了根除肿瘤和避免肿瘤再生，需要通过各种不同途径同时攻击肿瘤，大多数情况下选择联合用药。临床试验已证实，细胞因子的联合应用不仅能够提高疗效，而且能降低大剂量单因子应用产生的毒副作用。IL21和IL12均能增强CD8+T细胞和NK细胞的细胞毒活性，同时IL21可促进穿孔素和粒酶B的分泌，而IL12可诱导IFN-γ的分泌，因此推测IL21和IL12联合应用方案可能更优越。本研究证实在子宫内膜癌PBMCs的诱导培养中，IL21联合IL12比单用IL21和IL12更能显著增强PBMCs的细胞毒活性，从而进一步提高PBMCs的抗肿瘤活性。

最近研究发现，Treg细胞能抑制T细胞的增殖。Peluso等[19]证实IL21能促进T细胞的增殖，但不能抵抗Treg细胞介导的T细胞增殖抑制效应。而Comes等[20]和Li等[12]发现IL21能部分逆转Treg细胞的免疫抑制作用，当其浓度达到200ng/ml时可完全阻断Treg细胞的免疫抑制效应。本研究发现，子宫内膜癌患者的PBMCs经IL21(50 ng/ml)及IL12(5 ng/ml)诱导培养72h后，其增殖均无显著变化，推测其原因可能是诱导培养体系中Treg细胞介导的T细胞增殖抑制效应未完全消失或存在其他抑制因子，提示若进行肿瘤的细胞因子免疫治疗时，如何提高细胞毒T细胞的增殖需要进一步的研究。

综上，IL21和IL12可通过抑制Treg细胞的分化和PBMCs的凋亡，增强PBMCs的细胞毒活性，而且IL21联合IL12能进一步增强PBMCs的细胞毒活性，从而更有效地提高PBMCs的抗肿瘤活性。本研究也发现子宫内膜癌患者PBMCs的抗肿瘤活性与Th17细胞无关。本研究为子宫内膜癌的免疫治疗提供了依据，但IL21联合IL12还需在临床试验中进一步验证其安全性和有效性。

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EffectofInterleukin21and/orInterleukin12ontheAntitumoractivityofPeripheralBloodMononuclearCellsinPatientswithEndometrialCancer

TIAN Yong-ju1, CUI Bao-xia1, MA Dao-xin2, ZHANG Yan1,3, HOU Fei1, ZHANG Wen-jing1

1Department of Obstetrics and Gynecology,2Haematology Oncology Center, Qilu Hospital,
Shandong University, Jinan 250012, China
3Department of Obstetrics and Gynecology, Weifang People’s Hospital, Weifang, Shandong 261041, China

CUI Bao-xia Tel: 0531-82169568，E-mail： baoxiacui@hotmail.com

ObjectiveTo observe the role of interleukin (IL) 21 alone, IL12 alone, and IL21 plus IL12 for inducing the antitumor activity of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in patients with endometrial cancer.MethodsPBMCs were isolated from peripheral blood in patients with endometrial cancerinvitro, and kept the culture with low-level IL2. IL2-stimulated PBMCs were cocultured under different conditions (with anti-IL21 antibody, IL21 alone, IL12 alone, or IL21 plus IL12) for 72 h. The cytotoxicity of PBMCs was then examined by lactate dehydrogenase(LDH) released assay. CD4+CD25+FOXP3+T regulatory (Treg) cell and CD4+IL17A+T-helper (Th17) cell proportion were determined with flow cytometry. Cell proliferation and apoptosis were measured by cell counting kit-8(CCK-8)assay and flow cytometry, respectively.ResultsIn comparison to control group, both IL21 and IL12 significantly enhanced the cytotoxicity of PBMCs. The IL21 plus IL12 group had superior effect to IL21 alone and IL12 alone. IL21 and IL12 significantly decreased the percentages of Treg cells and the rate of PBMCs apoptosis. IL21 or IL12 had no significant effect on the differentiation of Th17 cells and the proliferation of PBMCs.ConclusionsIL21 and IL12 can enhance the cytotoxicity of PBMCs in patients with endometrial cancer, which can be further strengthened with treatment of IL21 plus IL12. Such effects may be achieved by inhibiting the differentiation of Treg cells and the apoptosis of PBMCs, but not by the differentiation of Th17 cell.

cytokines; peripheral blood mononuclear cells; cytotoxicity; regulatory T cells; T helper 17 cells

ActaAcadMedSin, 2011,33(3):292-298

崔保霞 电话：0531-82169568, 电子邮件：baoxiacui@hotmail.com

R737.33

A

1000-503X(2011)03-0292-07

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.03.017

国家自然科学基金(30400475)、山东省优秀中青年科学家科研奖励基金计划(2006BS03060)和留学回国科研基金 Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (30400475), the Shandong Technological Development Project (2006BS03060)，and the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars

2010-10-12)