氯原酸对db/db小鼠糖脂代谢紊乱的影响及其作用机制

张兰涛，常翠青，刘 阳，陈志民

北京大学 第三医院运动医学研究所，北京 100191

·减重、糖尿病手术及综合治疗论坛论著·

氯原酸对db/db小鼠糖脂代谢紊乱的影响及其作用机制

张兰涛，常翠青，刘 阳，陈志民

北京大学 第三医院运动医学研究所，北京 100191

目的研究氯原酸(CGA)对自发性肥胖糖尿病db/db小鼠糖脂代谢紊乱的影响及其作用机制。方法将13只5～6周龄雄性db/db小鼠随机分为db/db-CGA组(n=7)和db/db-CON组(n=6)，13只5～6周龄雄性db/m小鼠随机分为db/m-CGA组(n=6)和db/m-CON组(n=7)；CGA组均给予80 mg/(kg·d)CGA灌胃，CON组均给予等体积PBS灌胃。12周后检测血浆、肝脏、骨骼肌中糖脂生化指标，内脏脂肪组织中脂联素和内脂素含量，肝脏葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)和过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)的mRNA水平及其蛋白表达。结果给予CGA 12周后，db/db-CGA组小鼠血浆、肝脏和骨骼肌中三酰甘油含量和空腹血糖均明显低于db/db-CON组(P均<0.05)，肌糖原含量明显高于db/db-CON组(P<0.05)；脂联素水平明显高于db/db-CON组(P<0.01)，低于db/m-CGA组(P<0.05)；内脂素水平明显低于db/db-CON组(P<0.01)，高于db/m-CGA组(P<0.05)；G-6-Pase mRNA表达水平较db/db-CON组明显下降(P<0.05)， PPAR-α mRNA和蛋白表达水平均较db/db-CON组明显升高(P<0.05)。结论CGA可改善自发性肥胖糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱，其机理可能与调节脂肪因子分泌，上调肝脏PPAR-α水平及抑制G-6-Pase表达有关。

氯原酸；糖脂代谢；脂联素；内脂素；db/db小鼠

氯原酸(chlorogenic acid，CGA)是一种由咖啡酸与奎尼酸缩合而成的酚酸，广泛存在于植物性食物和咖啡饮品中，也是中草药金银花的主要功效成分。近年研究显示，CGA可以显著改善糖、脂代谢紊乱，提高胰岛素敏感性[1-5]，提示CGA对2型糖尿病的预防和治疗具有重要作用。db/db小鼠是一种自发性肥胖糖尿病模型，其与人类2型糖尿病发病过程相似，因此广泛用于糖尿病的实验研究。本研究采用db/db小鼠，观察了CGA对自发性肥胖糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱的影响，探讨了CGA防治糖尿病的作用和机理，以期为防治糖尿病提供新的科学依据。

材料和方法

材料CGA：绿色咖啡豆提取物(纯度99%，美国Acros公司)，采用PBS(pH 7.4)配制成20 mg/ml的CGA溶液，现用现配。空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)和三酰甘油(triglyceride，TG)试剂盒购自北方中控科技股份有限公司，游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，肌糖原及肝糖原试剂盒购自南京建成生物工程研究所，胰岛素、脂联素、内脂素酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自美国RB公司，RNA提取试剂盒购自北京博大泰克生物公司，逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR) 试剂盒购自北京天根生物公司；过氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPAR-α)兔抗鼠多克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔抗鼠多克隆抗体购自美国Bioworld公司，羊抗兔荧光二抗购自美国LI-COR公司。

实验动物及分组5～6周龄雄性C57BL/BKS db/db小鼠13只，体重20～25 g，随机分为db/db-CGA组(n=7)和db/db-CON组(n=6)。5～6周龄雄性db/m小鼠13只，体重15～20 g，随机分为db/m-CGA组(n=6)和db/m-CON组(n=7)。实验动物均购自北京大学医学部实验动物科学部，所有CGA组均给予CGA 80 mg/(kg·d)灌胃，CON组则给予等体积PBS灌胃，实验期间连续监测进食量，每10 d监测小鼠体重。干预12周，禁食12 h后处死，摘眼球取血，分离血浆。脱颈椎后取肾脏和睾丸周围脂肪组织、肝脏、骨骼肌放入液氮保存。

生化指标检测采用酶比色法检测FPG、TC和TG，改良铜试剂比色法检测FFA，比色法检测肌糖原和肝糖原，酶标法检测血清胰岛素和脂肪组织脂联素、内脂素，氯仿匀浆法处理肝和肌肉组织后，酶比色法测定肝脏及骨骼肌TG[6]。

肝脏葡萄糖-6-磷酸酶和PPAR-αmRNA表达检测采用Trizol试剂盒提取肝脏总RNA。cDNA合成：取总RNA 2 μg，Oligo(dT)2 μl，dNTP 2 μl，用ddH2O定容至14.5 μl；70℃加热5 min后迅速冰上冷却2 min，加入RNasin 0.5 μl，5×First-Strand Buffer 4 μl，TIANScriptM-MLV 1 μl，用ddH2O使总体积达20 μl。逆转录反应条件：42℃ 50 min，95℃ 5 min，所得产物用于PCR扩增。引物序列如下：(1)肝脏葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G-6-Pase)上游：5’-TCCTGGGACAGACACACAAG-3’，下游：5’-CAACTTT- AATATACGCTATTGG-3’；(2)PPAR-α上游：5’-ATGTCCGTGGAGACCGTCAC-3’，下游：5’-GGTTCTTAA- GGAACTCGCGTG- 3’；(3)GAPDH上游：5’-AGGCCGGTGCTGAGTATGTC-3’，下游：5’-TGCCTGTTCACCACCTTCT-3’。PCR扩增：取cDNA 2 μg，ddH2O 9.5 μl， PCR Mastermix 12.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，用ddH2O定容至25 μl。PCR反应条件：(1)G-6-Pase: 94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共35个循环；72℃ 10 min。(2)PPAR-α：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共35个循环；72℃ 10 min。取5 μl反应液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，Sygene Bio-ID凝胶成像系统采集图片，进行灰度分析。分别采用G-6-Pase、PPAR-α与GAPDH条带灰度值的比值作为其mRNA表达量参数。

肝脏PPAR-α蛋白表达水平检测采用放射性免疫沉淀(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液提取肝脏总蛋白，取100 μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，湿法电转2 h至硝酸纤维素膜(NC膜)，5%脱脂奶粉常温下封闭2 h，放入兔抗鼠PPAR-α多克隆一抗工作液(1∶500)中，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，将洗涤后的NC膜放入山羊抗兔荧光二抗工作液中(1∶10 000)，常温下避光慢摇1 h，TBST 洗膜3次，每次10 min。用Odyssey红外荧光扫描仪进行扫描，并用其软件进行条带灰度分析。

结 果

db/db小鼠一般情况整个实验期间，db/db组小鼠的进食量均显著高于db/m小鼠(P<0.05)；但无论是db/db小鼠还是db/m小鼠，CGA组与对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。db/db小鼠的体重、体脂百分比、FPG、TG、TC及肝脏和骨骼肌中的TG含量均明显高于db/m小鼠 (P均<0.05)，符合自发性肥胖糖尿病模型。

CGA对体重、Lee′s指数和体脂百分比的影响给予CGA 12周后，db/db-CGA组小鼠的体重、Lee′s 指数和体脂百分比与db/db-CON组相比差异无统计学意义(P均>0.05)；db/m-CGA组小鼠与db/m-CON组相比差异也无统计学意义(P均>0.05)(表1)。

CGA对血生化指标的影响给予CGA 12周后，db/db-CGA组小鼠的FPG和TG水平明显低于db/db-CON组(P均<0.05)，且TG降低至正常水平，与db/m-CGA组小鼠差异无统计学意义(P均>0.05)；血浆TC、FFA、胰岛素水平与db/db-CON组相比差异无统计学意义(P均>0.05)。db/m-CGA组小鼠的各项指标与db/m-CON组间差异均无统计学意义(P均>0.05)(表2)。

CGA对肝脏、骨骼肌中脂质和糖原含量的影响给予CGA 12周后，在db/db-CGA组小鼠肝脏和骨骼肌中的TG水平分别较db/db-CON组降低21%和32%(P均<0.05)，肌糖原含量较db/db-CON组升高46%，差异均有统计学意义(P均<0.05)；肝脏中糖原含量与db/db-CON组相比差异无统计学意义(P>0.05)。db/m-CGA组小鼠上述各项指标与db/m-CON组间差异均无统计学意义(P均>0.05)(表2)。

表 1 氯原酸对db/db和db/m小鼠体重、Lee′s指数和体脂百分比的影响

表 2 氯原酸对db/db和db/m小鼠血生化指标、组织TG和糖原含量的影响

FPG：空腹血糖；FFA：游离脂肪酸；TG：三酰甘油；TC：总胆固醇；与db/db-CON组相比，aP<0.05

FPG：fasting plasma glucose；FFA：free fatty acid；TG：triglyceride；TC：total cholesterol；aP<0.05 compared with db/db-CON group

CGA对脂肪组织脂联素和内脂素含量的影响给予CGA 12周后，db/db-CGA组小鼠脂肪组织的脂联素水平为(6.45±1.56)mg/L，较db/db-CON组的(3.52±1.00)mg/L明显提高了83%(P<0.01)，明显低于db/m-CGA组的(18.7±5.48)mg/L(P<0.05)；内脂素水平为(6.32±2.05)ng/ml，较db/db-CON组的(17.8±4.82)ng/ml明显降低64%(P<0.01)，明显高于db/m-CGA组的(2.64±0.48)ng/ml(P<0.05)。db/m-CON组小鼠的脂联素水平为(18.8±2.97)mg/L，明显高于db/db-CON组(P<0.05)；内脂素水平为(3.51±0.92)ng/ml，明显低于db/db-CON组(P<0.05)。

CGA：氯原酸；G-6-Pase：葡萄糖-6-磷酸酶； GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；与db/db-CON组比较，aP<0.05CGA：chlorogenic acid; G-6-Pase: glucose-6-phosphatase; GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;aP<0.05 compared with db/db-CON group

CGA对肝脏G-6-Pase和PPAR-αmRNA表达水平的影响给予CGA12周后，db/db-CGA组小鼠肝脏G-6-Pase mRNA表达水平较db/db-CON组下降51%(P<0.05)(图1)， PPAR-α mRNA表达水平较db/db-CON组升高60%(P<0.05)(图2)。

CGA对肝脏PPAR-α的蛋白表达水平的影响给予CGA12周后，db/db-CGA组小鼠肝脏PPAR-α 蛋白表达量较db/db-CON组升高89%(P<0.05)(图3)。

讨 论

db/db小鼠是一种leptin基因受体缺陷而引起的自发性肥胖糖尿病模型，其体内糖脂代谢紊乱与人2型糖尿病发生相似。本研究通过对db/db小鼠进行12周的CGA干预，发现CGA能够显著降低db/db小鼠FBG及血浆、肝脏和骨骼肌中的TG水平，与前期利用高脂诱导的体外细胞和动物体内糖脂代谢紊乱的作用结果一致[4-5]，表明CGA不仅对高脂诱导肥

PPAR-α：过氧化物酶体增殖物激活受体-α；与db/db-CON组比较，aP<0.05PPAR-α: peroxisome proliferator-activated receptor-α; aP<0.05 compared with db/db-CON group

与db/db-CON组比较，aP<0.05aP<0.05 compared with db/db-CON group

胖所致糖脂代谢紊乱有调节作用，对自发性肥胖糖尿病中的糖脂代谢紊乱也具有显著改善作用。

肥胖糖尿病机体肝脏葡萄糖产生增多(糖异生和糖原分解)和肌肉葡萄糖摄取减少可导致血糖升高[7]。G-6-Pase是糖异生的关键酶之一，其表达的下降能够显著降低FBG。肌糖原作为体内糖储存和外周糖利用的途径之一，在血糖维持上也起重要作用。本研究发现CGA在降低db/db小鼠FBG的同时，下调了肝脏G-6-Pase的mRNA表达水平，增加了肌糖原含量，而肝糖原无显著变化，表明CGA可能作为G-6-Pase抑制剂[8]，减少肝糖输出，以及增加外周组织肌糖原储备，而发挥其降血糖作用。

内脏脂肪组织作为内分泌器官，分泌脂肪因子如脂联素、内脂素、抵抗素等，这些脂肪因子与肥胖糖尿病的胰岛素抵抗有着密切联系[9]。PPAR-α是配体激活转录因子受体之一，能够增强线粒体脂肪酸β氧化，降低脂质合成，从而减少脂质沉积，改善胰岛素抵抗[10]。研究显示，脂联素能够通过上调PPAR-α表达，增强胰岛素敏感性，改善糖脂代谢紊乱[11-12]。肥胖糖尿病患者内脏脂肪含量较健康人增多，其体内血清脂联素水平显著下降，内脂素水平显著高于正常人群。脂联素降低能够抑制机体AMPK通路和下调PPAR-α表达，使机体脂肪酸降低，脂质合成及骨骼肌葡萄糖转运下降，影响糖脂代谢[13]；升高的内脂素能够促进炎症因子产生，引起机体慢性低度炎症，从而导致胰岛素抵抗，影响糖脂代谢[14]。本研究结果显示，CGA可以显著增加db/db小鼠内脏脂肪组织中脂联素含量，降低内脂素含量，上调肝脏PPAR-α mRNA和蛋白表达水平，增加肌糖原，降低肝脏和骨骼肌TG水平；Cho等[12]在高脂诱导肥胖ICR小鼠中发现，CGA可以促进脂联素分泌，增加一系列脂肪酸氧化酶活性，这些结果提示CGA可能通过调节内脏脂肪组织脂联素和内脂素分泌，增加胰岛素敏感性，促进肝外组织葡萄糖转运，增强脂肪氧化，改善肥胖糖尿病的糖脂代谢紊乱，降低血糖和血脂。值得注意的是，本研究中没有观察到体脂含量的变化，提示CGA可能通过更新内脏脂肪组织，改善脂肪因子分泌。

此外，本研究在连续12周的干预过程中，未发现CGA对db/m小鼠的糖脂代谢有任何不良影响，提示CGA对正常小鼠的糖脂代谢无不良反应，这为利用CGA预防和治疗2型糖尿病提供了安全性评价依据。

本研究的重要发现是长期给予CGA能够改善自发性肥胖糖尿病糖脂代谢紊乱，其作用可能与调节脂肪因子分泌，上调肝脏PPAR-α表达及减少肝糖输出、增加肌糖原储备有关，其详细机理仍需进一步研究，以便为CGA调节糖脂代谢，防治2型糖尿病提供新的途径和方法。

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EffectofChlorogenicAcidonDisorderedGlucoseandLipidMetabolismindb/dbMiceandItsMechanism

ZHANG Lan-tao,CHANG Cui-qing,LIU Yang,CHEN Zhi-min

Institute of Sports Medicine, the Third Hospital, Peking University, Beijing 100191,China

CHANG Cui-qing Tel:010-82265635, E-mail:cuiqingchang@yahoo.com.cn

ObjectiveTo explore the effect of chlorogenic acid on disordered glucose and lipid metabolism in db/db mice and its mechanism.MethodsThirteen 5-6-week-old male db/db mice were randomly divided into db/db-CGA group (n=7) and db/db-CON group (n=6), and thirteen 5-6-week-old male db/m mice were randomly divided into db/m-CGA group (n=6) and db/m-CON group (n=7). Mice in the CGA groups were administrated with CGA 80 mg/(kg·d)by gavage, and mice in the CON groups were administrated with PBS in the same volume by gavage. Twelve weeks later, the level of biomedical parameters in plasma, liver, and skeletal muscle were determined, the concentrations of adiponectin and visfatin in visceral adipose, and the mRNA expression of glucose-6-phosphatase (G-6-Pase) and peroxisome proliferators-activated receptor-α (PPAR-α) as well as the protein level of PPAR-α in liver were detected.ResultsTwelve weeks after CGA administration, the levels of triglycerides in plasma, liver, and skeletal muscle and the fasting plasma glucose in db/db-CGA group were significantly lower than those in db/db-CON group(P<0.05). The muscle glycogen level was significantly higher than that in db/db-CON group (P<0.05), and the adiponectin concentration was significantly higher than that in db/db-CON group (P<0.01) and lower than that in db/m-CGA group(P<0.05). The visfatin concentration in db/db-CGA group was significantly lower than that in db/db-CON group (P<0.01) and significantly higher than that in db/m-CGA group(P<0.05). The mRNA expression level of G-6-Pase was significantly down-regulated in db/db-CGA group when compared with db/db-CON group (P<0.05). Both the mRNA and the protein expression levels of PPAR-α were significantly up-regulated in db/db-CGA group(P<0.05) compared with in db/db-CON group.ConclusionCGA improves the disordered glucose/lipid metabolism in db/db mice, which is speculated to be related with its role in modulating the adipokines secretion, up-regulating hepatic PPAR-α, and inhibiting G-6-Pase expression.

chlorogenic acid; glucose-lipid metabolism; adiponectin; visfatin; db/db mice

ActaAcadMedSin，2011，33(3)：281-286

常翠青 电话：010-82265635,电子邮件:cuiqingchang@yahoo.com.cn

R151.2

A

1000-503X(2011)03-0281-06

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.03.015

国家自然科学基金(30872112)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (30872112)

2011-04-08)