RP-HPLC法测定中药木贼中黄酮醇苷的含量

李 颜,朱金辉,李 丹,郭 澄

(上海交通大学附属第六人民医院药剂科，上海 200233)

·药物分析·

RP-HPLC法测定中药木贼中黄酮醇苷的含量

李 颜,朱金辉,李 丹,郭 澄

(上海交通大学附属第六人民医院药剂科，上海 200233)

目的建立以高效液相法测定中药木贼中一个黄酮醇苷山奈酚-3-双葡萄糖苷的含量方法。方法色谱柱为Calesil ODS-100(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流动相为甲醇-水(45:55)，流速为1.0 ml/min, 检测波长254 nm, 柱温30 ℃,进样量10 μl。结果山奈酚-3,7-双葡萄糖苷的检测浓度在0.003 12～0.104 mg/ml范围内与峰积分面积呈良好线性关系(r=0.999 9), 平均回收率为100.2%，RSD=1.74% (n=9)。3个不同产地批号的样品中山奈酚-3-双葡萄糖苷的含量均在0.30%以上。结论该方法简便、快捷、重复性好，可作为木贼药材的质量控制的方法。

木贼；黄酮醇苷；山奈酚-3-双葡萄糖苷；反相高效液相法；含量测定

中药木贼为木贼科木贼属植物木贼Equisetum hiemale L. 的干燥地上部分。为《中国药典》2010版收载品种，具有散风热、明目退翳的功效，可用于治疗风热眼赤，迎风流泪，目生云翳等病症[1]。现代植物化学研究表明木贼中主要含有黄酮和黄酮苷类成分，包括:山奈酚苷(山奈酚-3-双葡萄糖苷(kaempferol-3-diglucoside)、山奈酚-3-双葡萄糖-7-葡萄糖苷(kaempferol-3-diglucoside-7-glucoside)、山奈酚-3-葡萄糖-7-双葡萄糖苷(kaempferol-3-glucoside-7-diglucoside)、草棉苷(herbacitrin)、芹菜素(apigenin)、木犀草素(luteolin)等[2～3]。现代药理学研究表明木贼科植物的不同提取物或极性部位具有抗心肌缺血、降血压、降血脂、镇痛、保肝及抗肿瘤等多方面的生物活性[4]。2010版《中国药典》中木贼的质量控制方法为HPLC测定药材75%甲醇提取液加盐酸水解后的山奈素的含量。本实验前期的植物化学的研究中(植物化学研究将另发文报道)，发现木贼中主要含有的是以山奈酚为苷元的苷类化合物，所以本实验对其中一个主要的黄酮醇苷进行了HPLC定量分析，更加直接的反映木贼的品质，为进一步提高木贼的质量标准提供参考依据。

1 材料

1.1仪器 美国waters 高效液相色谱仪(600四元泵，在线脱气机，2707自动进样器，2998 PDA检测器)；柱温箱(Auto Science AT-330)；BP211D分析天平(德国赛多利斯公司)；JA2003型分析天平(上海良平仪器仪表有限公司)；KQ5200DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TC-15套式恒温器(海宁新华医疗器械厂)；色谱柱：Calesil ODS-100 250 mm×4.6 mm 5 μm (上海申越公司)；甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司)，超纯水(美国Millipore simplicity 185纯水系统)，95%乙醇(药用级，上海怡峰化工有效公司)，甲醇、无水乙醇(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)。

1.2试药 山奈酚-3-双葡萄糖苷对照品(自制，其化学结构经FAB-MS,1H-NMR,13C-NMR和DEPT谱确证，面积归一化法检测纯度大于98%)；木贼药材购自上海虹桥中药饮片厂,经上海交通大学郭澄教授鉴定其原植物为木贼科木贼EquisetumhiemaleL.的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱 Calesil ODS-100 C18(250 mm×4.6 mm , 5 μm)；流动相:甲醇-水 (45:55)；流速1.0 ml/min, 检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。

2.2对照溶液的制备 精密称取对照品2.60 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇制成1.0 ml含0.104 mg对照品的溶液，摇匀，即得对照品储备液，备用。

2.3供试品溶液的制备 精密称取过3号筛的木贼干燥粉末0.1 g，加水10 ml，称重，超声处理45 min，取出，放置至室温，再称重，用水补足失重，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4线性关系考察 精密吸取“2.2”项下对照品储备液0.3、0.5、1.0、5.0 ml，分别置于10 ml容量瓶中，甲醇定容，摇匀。按“2.1”色谱条件进行分析。以进样浓度 (C) 为横坐标，峰面积积分值(A)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A=1E+7C+6 235.5 (r=0.999 9，n=5)。结果表明，对照品检测浓度在0.003 12～0.104 mg/ml范围内与峰积分面积呈良好线性关系。

2.5仪器精密度试验 取浓度0.010 4 mg/ml对照品溶液，按“2.1”色谱条件重复进样6次进行分析。结果，对照品峰面积的RSD=0.86%，表明仪器精密度较好。

2.6稳定性试验 取同一样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12 h按上述色谱条件进行分析。结果，木贼中该黄酮醇苷的峰面积的RSD=2.94%，表明供试品溶液在12 h内稳定性较好。

2.7重复性试验 精密称取同一批样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果，木贼中该黄酮醇苷的含量的RSD=3.20%，表明方法重复性较好。

2.8加样回收率试验 取已知含量的样品6份，分别精密加入3个不同浓度(样品含量50%, 100%, 150%)的对照品溶液, 照按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

2.9样品的含量测定 取不同来源的木贼样品各0.1 g，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积并用外标法计算样品中该黄酮醇苷的含量。色谱图见图1，样品含量测定结果见表2。

表1 加样回收率试验结果(n=9)

图1 高效液相色谱图

产地批号平均含量(%)RSD(%)甘肃0804280．360．85黑龙江0909010．492．15辽宁0906050．392．06

3 讨论

3.1木贼中主要含黄酮及其苷类化合物，其中以苷类为主，故对其提取溶媒和提取方法进行了筛选优化。选择了不同浓度的乙醇(30%、50%、75%)、水和甲醇为提取溶媒进行超声提取，以黄酮醇苷的提取率为考察指标，结果显示，水为溶媒时的提取率最高。以水为提取溶媒考察超声提取和加热回流提取的提取率，结果显示在相同时间内超声提取和加热回流提取率无差异，因此选择操作简便的超声提取为提取方法。确定提取溶媒和提取方法后，分别考察了不同的超声时间(30、45、60 min)对提取的影响，结果表明，超声提取45 min即可达到最大提取率。

3.22010版《中国药典》中控制木贼质量含量方法中测定的，其操作步骤相对繁琐，容易产生误差，且未能直接反应药材的品质。也有不同学者对木贼的质量进行了研究，用薄层扫描法测黄酮苷或水解后测槲皮素、山奈酚的含量[5～8]；本研究中建立的方法，简单、快捷并且能直接反映药材的品质，可作为木贼质量标准的参考依据。

3.3木贼科其它种植物中同样含有大量的黄酮醇苷类化合物。此类黄酮醇苷类化合物在抗氧化、抗炎、镇痛等方面的活性也逐步被发现[9,10]，与木贼在临床上用其清热解毒的功效具有一定的相关性，因此选用黄酮醇苷作为木贼的质量控制指标成分更为合理。

[1] 中国药典2010年版[S]. 一部.2010:58.

[2] 李淑惠,靳丹虹,李德坤,等. 木贼科植物研究概况I.化学成分研究[J].中草药.2000,31(7):附12.

[3] 张承忠,赵 磊,李 冲,等. 木贼化学成分研究[J].中草药.2002,33(11):978.

[4] 朴惠顺,金光洙. 木贼的化学成分和药理作用研究进展[J].时珍国医国药,2006,17(6):1077.

[5] 高汉成,何明三,韩宁涛. 木贼乙醇提取物中槲皮素HPLC法含量测定的研究[J].湖北中医学院学报,1999,1(3):29.

[6] 张 宪,赵惠萍,张小茜,等. 木贼质量标准的研究[J].中国中医药信息杂志,2005,12(5):48.

[7] 赵 磊,李 冲,张承忠,等. 木贼中三种黄酮苷的含量测定[J].中国现代应用药学杂志,2005,22(2):159.

[8] 隋长惠,王玉洁,王昌库.木贼中山奈酚的含量测定[J].沈阳药科大学学报,1996,13(2):121.

[9] Do Monte FH, dos Santos JG Jr, Russi M,etal. Antinociceptive and anti-inflammatory properties of the hydroalcoholic extract of stems from Equisetum arvense L. in mice[J]. Pharmacological research, 2004(49):239.

[10] Correia H, Gonzalez-Paramas A, Amaral M.T.,etal. Characterisation of polyphenols by HPLC-PAD-ESI/MS and antioxidant activity in Equisetum telmateia[J]. Phytochemical analysis, 2005(16):380.

2010-07-13

[修回日期] 2009-08-31

DeterminationofaflavonolglycosideinEquisetumhiemalebyRP-HPLC

LI Yan, ZHU Jin-Hui, LI Dan，GUO Cheng

(Department of Pharmacy, Shanghai Sixth People′s Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China)

ObjectiveTo establish a RP-HPLC method for determination of a flavonol glycoside in Equisetum hiemale.MethodsThe separation was performed on Calesil ODS-100(250 mm×4.6 mm,5 μm). Mobile phase consisted of methanol-water (45:55) with flow rate of 1.0 ml/min and detection wavelength of 254 nm. The column temperature was 30 ℃ and injection volume was 10 μl.ResultsThe linear range of the flavonol glycoside was 0.003 12～0.104 mg/ml with average recovery of 100.2% (RSD=1.74%,n=9 ). The method was applied to samples of Equisetum hiemale from different locations.ConclusionThe established method was proved to be simple, reproducible, accurate and could be used to evaluate the quality of Equisetum hiemale.

Equisetum hiemale; flavonal glycoside; kaempferol-3-diglucoside；RP-HPLC; Content determination

李 颜(1979-)，女，药师，硕士.Tel：(021)64369181-8789,E-mail:lycft@163.com.

郭 澄.Tel：(021)64369181-8089,E-mail:gboss@126.com.

R917

A

1006-0111(2011)01-0033-03