慢性束缚应激对大鼠体质量、血清皮质酮和前额叶皮质cAMP－PKA－CREB－BDNF通路的影响

孟珊珊 刘洪文

抑郁症是一种常见的精神障碍，它以情感病态变化（主要是情绪低落）为显著特征。抑郁症的发生与多种因素有关，其中很重要的一个因素就是机体持续暴露于应激条件下。尽管一定程度的应激是有益的。但是机体长时间处于应激状态下会导致抑郁症的发生［1～3］。不同的应激模型被用来研究应激反应的不同方面。慢性束缚应激作为一种慢性应激模型，已被广泛的应用到应激相关的精神疾病基础研究中［4，5］。慢性束缚应激模型是将动物持续暴露于不可逃避的束缚应激。本研究采用这种模型，观察应激后大鼠的体质量、血清皮质酮和前额叶皮质cAMP－PKA－CREB－BDNF通路的变化，为探索应激发生的分子病理机制提供线索。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性Sprague－Dawley大鼠30只。体重180～200 g，购自哈尔滨医科大学动物中心；大鼠购回后适应1周开始实验，置于自然昼夜节律光照条件下，在标准洁净的啮齿动物笼内饲养，垫料为木屑，每4 d更换1次，自由进食、饮水，每笼2～3只，控制室温（22±2）℃；大鼠随机分为3组：对照组、慢性束缚应激1周组和慢性束缚应激2周组，每组各10只。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立 （1）对照组不做任何应激处理，仅在应激组应激阶段禁水禁食；（2）慢性束缚应激组分别进行1周和2周慢性束缚应激；慢性束缚应激是将应激组大鼠置于有机玻璃制成的束缚管中，管壁凿有直径0.4 cm 的小孔，确保通风良好；大鼠在束缚管中有限的空间活动，但不会造成肉眼可见的躯体上的伤害；大鼠每日应激6 h（9：00～15：00），连续进行1周和2周，每日应激阶段禁水禁食，应激结束后将其放回正常饲养的笼具中，此时可以自由饮水进食。

1.2.2 体质量测量 所有大鼠均在应激前、应激1周和2周后用电子动物秤称体质量1次。体质量增加量等于每周末体质量减去每周开始时体质量。

1.2.3 血清皮质酮浓度测定 最后一次实验结束后第2 d上午10：00～11：00，麻醉后处死大鼠，断头取血，置于离心管内，室温下4000 r／min 离心10 min，取上清液置－20℃冰箱保存，待测皮质酮水平；采用酶联免疫吸附试验（Enzyme－Linked Immunosorbent Assays，ELLISA）法测定皮质醇浓度，操作步骤按照皮质酮试剂盒说明书（DE3600，R＆D Systems，Inc）进行。

1.2.4 额叶皮质cAMP 含量、PKA 活性和BDNF表达水平测定

将皮质组织于4℃复温，加入2 ml预冷50 mmol／L醋酸缓冲液（pH4.75），匀浆后静置5 min，3500r／min离心15 min，收集上清液；60℃烘干后，4℃保存待测，采用放免法测定cAMP含量，ELISA法测定BDNF 表达水平（西唐生物公司）。另取皮层组织约50 mg，加入PKA 抽提缓冲液0.25 ml［25 mmol／L Tris－HCl（pH7.14），0.5 mmol／L EDTA，0.5 mmol／L EGTA，10 mmol／Lβ巯基乙醇，1μg／L亮肽素，1μg／L 抑肽酶］，冰浴上匀浆；将匀浆液倾入离心管中，4℃、3500 r／min离心5 min，吸取上清液，测定时按试剂盒（Promega公司）说明书步骤操作，酶活性单位为units／ml。

1.2.5 蛋白免疫印迹（Western－blotting） 各组大鼠在断头取血测血清皮质酮浓度的同时，取双侧前额叶皮质标本，冰上裂解、匀浆，取上清液；经蛋白定量后聚丙烯酰胺凝胶（SDS－PAGE）电泳、蛋白质的电转移和膜封闭；封闭结束后分别用小鼠抗大鼠p－CREB抗体溶液、兔抗大鼠CREB 抗体溶液和小鼠抗大鼠β－actin抗体溶液室温孵育，以上三种抗体均购自Sigma公司；二抗孵育后显色、曝光、显影及扫描免疫印迹条带并进行分析。

1.2.6 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件，实验数据以均数±标准差（±s）表示，各组比较采用单因素方差分析（PostHoc LSD 法），各组自身前后比较采t检验。

2 结 果

2.1 大鼠体质量的变化

第1周应激组大鼠体质量增长［（35±11）g与对照组（59±16）g］相比明显降低（P＜0.05）；第2周应激组体质量增长［（23±8）g］明显低于对照组［（68±14）g］（P＜0.05）（图1）。

图1 应激组与对照组大鼠体质量增长比较与第1周对照组比较，＊P＜0.05；与第2周对照组比较，＃P＜0.05

2.2 大鼠血清皮质酮水平的变化

对照组、束缚应激1周组和束缚应激2周组大鼠血清皮质醇浓度分别为（198.21±101.35）ng／ml、（356.78±112.21）ng／ml和（558.49±98.32）ng／ml，应激各组均高于对照组（表1）。

表1 大鼠血清皮质酮水平（ng／ml）

2.3 前额叶皮质cAMP－PKA－CREB－BDNF 通路的变化

慢性束缚应激1周和慢性束缚应激2周组大鼠前额叶皮质的cAMP 含量、PKA 活性和BDNF 表达水平显著低于对照组，p－CREB 蛋白表达相对水平分别为3.78±0.12和2.39±0.08，与对照组6.08±0.19相比较，差异明显（P＜0.01）（图2～5）。

图2 慢性束缚应激后大鼠前额叶皮质cAMP含量的变化

图3 慢性束缚应激后大鼠前额叶皮质PKA 活性的变化

图4 慢性束缚应激后大鼠前额叶皮质p－CREB表达水平的变化

图5 慢性束缚应激后大鼠前额叶皮质BDNF表达的变化

3 讨 论

应激性事件是人类抑郁症的明显促发因素，并且慢性、低强度、长期的日常压力是引发抑郁的主要原因［6］。束缚制动作为一种较为纯粹的挫折应激，具有躯体应激小，能够较好地突出心理或情绪因素的特点，因此是一种较好的负性心理应激动物模型［4，5］。

与以往的研究结果相一致［7～9］，本实验观察到，与对照组相比应激大鼠第1 周出现体质量增长减少，随着应激次数的增加，其体质量增加减少更为突出，这提示慢性束缚应激抑制大鼠体质量的增长。慢性束缚应激引起体质量增长减少的原因很多，其中皮质酮升高是一个重要原因。有研究发现腹腔注射皮质酮明显抑制了大鼠体质量的增长［10］。皮质酮水平增高抑制体重增长可从皮质酮的生物学作用进行解释，皮质酮促进蛋白质分解，抑制其合成，同时也影响了糖和脂类的代谢，最终导致体重增长缓慢。本研究发现，慢性束缚应激引起血浆皮质酮水平明显升高。

大量研究表明，慢性应激时机体内稳态失衡，脑内可产生广泛的神经化学及形态学改变，最终导致大脑器质性损害。很多研究显示，转录因子环磷腺苷反应元件结合蛋白（CREB）与抑郁症的发病机制和治疗相关。强迫游泳引起大鼠海马和前额叶皮质磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶（p－ERK）和p－CREB分子水平的降低［11］。研究发现，慢性束缚应激明显抑制了大鼠前额皮质磷酸化的ERK1／2 的表达。CREB是ERK 通路的下游分子，研究发现慢性温和应激明显抑制大鼠海马齿状回BDNF 蛋白的表达和CREB 的磷酸化［12］。BDNF 是一种主要的神经营养因子，在海马和皮层中高水平表达，是神经元再生的关键因素［12］，BDNF的下调参与慢性应激对前额叶皮质损害。本实验结果显示，慢性束缚应激组大鼠前额叶皮质的cAMP 含量、PKA 活性、BDNF表达和p－CREB 含量较对照组明显降低，在应激反应中cAMP－PKA－CREB－BDNF信号通路被抑制，提示cAMP－PKA－CREB－BDNF 信 号 通 路 可能参与应激发生的机制。

1 陈树林.应激和抑郁症.国外医学精神病学分册，1998，25（3）：162－165.

2 张艳美.慢性应激、大脑损害与抑郁症.国外医学精神病学分册，2001，28（2）：105－109.

3 李云峰，罗质璞.应激诱发抑郁症机制的研究进展.生理科学进展，2002，33（2）：142－144.

4 王海涛，薛黎明，秦雪梅，等.慢性不可预知和慢性束缚应激抑郁模型大鼠行为学研究.山西大学学报：自然科学版，2010，33（1）：157－160.

5 Buynitsky T，Mostofsky DI.Restraint stress in biobehavioral research：Recent developments.Neurosci biobehav Rev，2009，33（7）：1089－1098.

6 刘顺发.我国抑郁症患病情况的流行病学研究现状.医学文选，2006，25（4）：861－863.

7 Christiansen SH，Olesen MV，Wörtwein G，et al.Fluoxetine reverts chronic restraint stress－induced depression－like behaviour and increases neuropeptide Y and galanin expression in mice.Behav Brain Res，2010，216（2）：585－591.

8 Ruth B，Harris S，Tifany D.Weight loss in rats exposed to repeated acute restraint stress is independent of energy or leptin status.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2002，282（1）：77－88.

9 Rybkin II，Zhou Y，Volaufova J.Effect of restraint stress on food intake and body weight is determined by time of day.Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol，1997，273（5）：1612－1622.

10 Gregus A，Wintink AJ，Davis AC，et al.Effect of repeated corticosterone injections and restraint stress on anxiety and depression－like behavior in male rats.Behav Brain Res，2005，156（1）：105－114.

11 Qi X，Lin W，Li J，et al.Fluoxetine increases the activity of the ERK－CREB signal system and alleviates the depressive－like behavior in rats exposed to chronic forced swim stress.Neurobiol Dis，2008，31（2）：278－285.

12 Gronli J，Bramham C，Murison R，et al.Chronic mild stress inhibits BDNF protein expression and CREB activation in the dentate gyrus but not in the hippocampus proper.Pharmacol Biochem Behav，2006，85（4）：842－849.