噬菌体表面展示文库筛选人干细胞因子模拟肽

苏 林，孔 燕，刘长征，杨克恭，陈松森

1中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京100005

2北京大学临床肿瘤学院 北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所肾癌和黑色素瘤内科，北京100036

人干细胞因子 (human stem cell factor，hSCF)是一种重要的造血细胞因子，主要作用于早期的造血干细胞和原始造血祖细胞，促进其增殖和分化。重组hSCF已用于临床，主要治疗贫血和肿瘤放化疗所致的骨髓抑制［1-2］。然而临床研究显示，部分患者使用重组hSCF会产生类过敏性反应，影响了其临床应用。业已证实，一些细胞因子和其受体的相互作用只需少量氨基酸残基的参与，由关键残基组成的短肽能够模拟蛋白质上的决定簇［3-5］，这使得设计小分子细胞因子模拟肽成为可能。与细胞因子相比，模拟肽具有相对分子质量小、免疫原性低、易于合成、不良反应小、可通过口服途径使用等优点，在药物合成领域具有广阔潜在的应用前景。迄今为止，造血细胞生长因子中具有人红细胞生成素 (erythropoietin，EPO)、人血小板生长因子 (thrombopoitin，TPO)及鼠粒细胞集落刺激因子 (granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)生物活性的模拟肽已广泛研究［6-9］，但尚未见具有hSCF生物活性模拟肽的报导。本研究以基因工程方法表达的hSCF受体［10-11］为靶蛋白，从噬菌体随机肽库中筛选出具有hSCF生物学活性的模拟肽，以期为深入研究hSCF模拟肽作用机制和临床应用的可行性奠定基础。

材料和方法

材料噬菌体展示文库:ph.D-C7CTM(1.2×1013pfu/ml，复杂度 =1.3×109转化子)，ph.D-12TM(1.5×1013pfu/ml，复杂度 =2.7×109转化子)，-28 gⅢ测序引物、-96 gⅢ测序引物、单链M13 DNA M13mp18均购自美国NEB公司;辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase，HRP)标记的抗-M13单克隆抗体购自美国Amersham公司。西安华辰生物科技有限公司合成小肽，PAGE纯化。基因重组hSCF(rhSCF)为成都地奥九泓制药厂产品;四甲基偶氮噻唑盐 ［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］购自美国Invitrogen公司;真核细胞中表达人干细胞因子受体 (c-Kit)配体结合区膜外N端1-3免疫球蛋白样结构域 (c-Kit/Igl-3)为本室研制。

细胞株UT-7细胞 (人类原巨核细胞白血病细胞)在37℃、5%CO2及饱和湿度下，添加0.4U/ml EPO的完全培养基 (RPMI-1640，含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10%胎牛血清)中培养。

酶联免疫吸附法筛选噬菌体文库以rc-Kit/Ig1-3为靶蛋白，分别对噬菌体环七肽库和十二肽库进行3轮筛选。第1轮筛选:将rc-Kit/Ig1-3蛋白溶解在包被缓冲液中，终浓度100 μg/ml，包被于96孔板中，4℃过夜;弃去包被液，封闭液 (5%脱脂奶粉)室温封闭1 h;弃去封闭液，加入10 μl原始文库和90 μl TBST(TBS+0.1%Tween-20)，混匀后室温孵育1 h;每孔加入100 μl洗脱缓冲液 (0.2 mol/L Glycine-HCl pH 2.2，1 g/L BSA)洗脱; 加15 μl 1 mol/L Tris-HCl(pH9.1)中和洗脱缓冲液。将洗脱液扩增、纯化和测滴度。将纯化好的噬菌体进行下一轮筛选。第2轮筛选:取适量第1轮筛选扩增的洗脱产物，重复上述步骤，包被时将rc-Kit/Ig1-3终浓度降为75 μg/ml，在清洗步骤中将Tween-20的浓度增至0.2%。第3轮筛选:取适量第2轮筛选扩增的洗脱产物，重复上述步骤，包被时将rc-Kit/Ig1-3终浓度降为50 μg/ml，在清洗步骤中将Tween-20的浓度增至0.5%。

噬菌体滴度测定在LB培养基中准备10倍系列稀释的噬菌体。接E.coliER2738单菌落于3 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期，分成200 μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度1管，每管加入10 μl不同稀释度的噬菌体，快速振荡混匀，室温温育5 min。将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal琼脂平板上，待平板冷却后，倒置于37℃培养过夜。选择约有102个噬菌斑的平板，并对平板上的噬菌斑进行计数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)，即为其滴度。

酶联免疫吸附法检测噬菌体与rc-Kit/Ig1-3的结合力用10 μg/ml的rc-Kit/Ig1-3包被96孔板，每个待鉴定克隆设3个复孔，另设3个BSA包被孔作为对照，4℃包被过夜。加封闭液4℃ 2 h。TBST洗板，对噬菌体进行梯度稀释，将稀释好的噬菌体加入包被有c-Kit/Ig1-3及对照的孔中。室温振荡作用2 h。TBST洗板后，加入1∶5000比例稀释的HRP标记抗-M13抗体，室温振荡作用1 h。加入100 μl HRP底物溶液，室温作用10 min，加入2 mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪记录495 nm处的吸光值。在竞争性酶联免疫吸附测定 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)中，每个克隆设6个孔，每孔预先包被rc-Kit/Ig1-3，然后加入噬菌体克隆，使其结合，其中3孔加入rc-Kit/Ig1-3溶液，3孔加入BSA溶液作为对照，以HRP标记的M13单克隆抗体检测，最后测定每孔的OD450值。

噬菌体单链DNA提取将ER2738过夜培养物按1∶100稀释接种于LB培养基，分1 ml到培养管中，用灭菌牙签挑一蓝色噬菌斑接种于上述1 ml培养管中，37℃摇床培养5 h，培养物转入微量离心管中，离心30 s。将含噬菌体上清转入一新鲜离心管。加入200 μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10 min。9000 g离心10 min，沉淀物彻底重悬于100 μl碘化物缓冲液中，加入 250 μl乙醇。室温温育 10 min，9000 g离心10 min，用70%的乙醇洗沉淀，抽干，沉淀重悬于30 μl TE中，使用-28 gⅢ或-96 gⅢ引物进行核苷酸序列测定。

合成小肽的生物学活性测定取对数期生长的UT-7细胞，PBS洗涤2次后显微镜下计数，将细胞浓度调整为6×105/ml，按照每孔50 μl将上述细胞悬液添加到96孔板孔中，再加入50 μl用完全培养基梯度稀释的合成肽溶液，选用rhSCF作为阳性对照，完全培养基作为阴性对照。37℃培养40 h，每孔加入 20 μl 5 g/L MTT，37℃ 培养 4 h，加入 100 μl 10%的酸化异丙醇 (9 ml异丙醇+1 ml Triton X-100+86.2 μl盐酸)，吹打溶解结晶，测OD570值。

统计学处理采用SPSS 13.0统计软件，数据以均值±标准差表示，活性比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

ELISA方法筛选噬菌体展示肽库以rc-Kit/Ig1-3为靶蛋白，包被ELISA平板，分别加入噬菌体环七肽库和十二肽库进行筛选，在筛选过程中，通过计算每一轮加入的噬菌体和得到的噬菌体的比，可以显示富集的程度。结果显示，筛选使结合的噬菌体得到了富集 (表1、2)。

噬菌体ELISA方法筛选高结合力单克隆经3轮筛选获得具有与rc-Kit/Ig1-3结合活性的噬菌体克隆共19个，其中从环七肽库筛选到11个 (CE3、CE4、 CE6、 CE12、 CE15、 CE16、 CE17、 CE19、CE21、CE23、CE24)，从十二肽库筛选到 8个(LE3、 LE4、 LE5、 LE10、 LE14、 LE15、 LE20、LE23)(图1)。

噬菌体克隆与靶蛋白的结合特异性验证挑选出11个与rc-Kit/Ig1-3结合活性较高的噬菌体单克隆(CE3、 CE12、 CE15、 CE16、 CE21、 CE23、 LE5、LE10、LE14、LE15、LE20)进行竞争性 ELISA实验，结果显示，与BSA相比，c-Kit/Ig1-3能够竞争性抑制噬菌体克隆与c-Kit/Ig1-3的结合 (图2)。

表2 c-Kit/Ig1-3筛选噬菌体十二肽库Table 2 Results of phage dodecapeptide library bio-panning with c-Kit/Ig1-3 as probe

图1 ELISA筛选高亲和力的噬菌体单克隆Fig 1 Phage clones with higher c-Kit/Ig1-3 or BSA-binding activity were detected using ELISA

图2 竞争性ELISA检测噬菌体克隆与c-Kit/Ig1-3结合的特异性Fig 2 Specific binding of phage clones to c-Kit/Ig1-3(black bars)or BSA(white bars)detected using competitive ELISA

高结合活性的噬菌体克隆测序结果选取与靶蛋白有较高结合活性的19个噬菌体克隆提取单链DNA，进行序列测定，结果显示环七肽库具有1个共有序列DPSPHTH，十二肽库没有共有序列 (核苷酸用三联字母表示，氨基酸用单字母表示)(表3)。经过比对，这些小肽与hSCF没有同源序列。利用NCBI PROTEIN BLAST分析也未发现与以上小肽完全一致的序列。

合成肽选择与c-Kit/Ig1-3结合活性较高的环七肽 CE3(CS1)、CE16(CS2)和十二肽 LE4(LS1)、LE20(LS2)进行化学合成。合成小肽的质谱分析结果显示，其相对分子质量依次为995.79、878.34、1399.35、1422.56，均与预期一致。4个小肽的序列如下:CS1:CDPSPHTHC;CS2:CPSSLTPAC;LS1:AVSSFERDNFVQ;LS2:THSFIPRLPLLK。

合成肽体外活性测定合成肽用无菌水溶解，分别用完全培养基稀释到540、180、60 μmol/L，然后加入96孔板培养的UT-7细胞中孵育，以SCF(5nmol/L)作为阳性对照，完全培养基作为阴性对照，检测小肽刺激UT-7细胞增殖的活性。结果显示，4种小肽均能促进UT-7细胞增殖，当浓度较高时，CS2和LS2活性明显高于阴性对照 (P＜0.05或P＜0.01)(图3);但明显低于阳性对照。

讨 论

噬菌体随机肽库是利用噬菌体展示技术［12-13］，将随机编码短肽的外源基因克隆到噬菌体载体中，使外源基因与噬菌体表壳蛋白pⅢ或pⅧ以融合的形式展示在噬菌体表面，构建具有高库容量 (目前可达109)的噬菌体展示多肽集合体。利用生物淘选的方法，对噬菌体肽库进行筛选，对筛选出的噬菌体克隆进行单链DNA的序列测定，从DNA序列推测氨基酸序列，然后进行短肽的生物合成。这种技术在蛋白质的基因型和表型之间建立了1个物理连接，实现了蛋白质遗传型和表型之间的互换，简化了蛋白质分子文库筛选与鉴定过程，因此该技术在确定蛋白质分子之间相互作用位点，寻找高亲和力的配体小分子，探索未知蛋白质空间结构表位等方面已有广泛应用。以细胞因子/生长因子受体作为靶分子，利用噬菌体随机肽库筛选配体模拟肽的研究备受人们关注。在造血细胞生长因子中，最为成功的是hEPO、hTPO模拟肽的获得和研究，PEG修饰或与Fc融合的hTPO模拟肽Romiplostin(ANG-531)和hEPO模拟肽Hematide(AF37702)已被美国食品药品监督管理局批准进行临床试验［9，14-15］，非肽型小分子hG-CSF受体拮抗物 (SB247464)是从有机化合物中分离出来［16］。张力群等［7］用噬菌体随机肽库展示技术筛选出具有鼠G-CSF活性的模拟肽。但迄今为止，尚未见具有hSCF模拟肽的报道。hSCF又称为肥大细胞生长因子，除能刺激造血干祖细胞的增殖分化外，还能刺激肥大细胞增殖。临床研究显示，应用rhSCF后部分患者产生类过敏反应，影响了临床使用。利用噬菌体展示技术，寻找具有hSCF生物活性的小肽，减少hSCF的不良反应，具有实际意义。本研究在这方面做了探索，采用噬菌体表面展示文库技术，经优化成功地从环七肽库和十二肽库中筛选到4个具有hSCF生物活性的小肽，其中CE16(CS2)和LE20(LS2)活性较高。尽管此实验结果有待于体内实验进一步确证，但其为开发具有hSCF功能的新型小分子肽以代替目前临床应用的有较强不良反应的rhSCF提供了新的线索，并为深入研究hSCF模拟肽的作用机制奠定了基础。

表3 噬菌体克隆测序Table 3 Sequences of phage clones

图3 MTT法测定小肽活性Fig 3 The activity of synthesized peptides determined by MTT assay

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