人脐带间充质干细胞的生物学特性和超微结构

朱少芳，何援利，付霞霏

南方医科大学附属珠江医院妇产科，广州510282

随着对间充质干细胞 (mesenchymal stem cell，MSC)的研究逐渐深入，人们发现MSC在脊髓损伤［1］、大面积骨缺损［2］、糖尿病肾病［3］和卵巢早衰［4］等众多领域均可发挥重要的作用。而干细胞的来源，也由当初单纯的骨髓［5］来源，发展到从脂肪［6］、皮肤［7］、脐带血［8］、胚胎［9］等组织中提取。但是，这些来源的MSC各有其优缺点，如:骨髓MSC的提取对患者可造成二次损伤，致瘤性、病毒及细菌污染较高;脐带血中提取的MSC量少，免疫原性高;胚胎来源的干细胞存在明显的伦理争议，培养困难［10］;脂肪来源的干细胞在细胞周期动力学变化及异常核型发展方面，有可能导致恶性细胞转化［11］。本研究分离和培养了人脐带 MSC，观察了MSC的生物学特性和超微结构，探讨了其在临床上的应用前景。

材料和方法

试剂和仪器DMEM-F12培养基、胰酶、胎牛血清购自美国HyClone公司，细胞计数试剂盒 (cell counting kit-8，CCK-8)购自上海碧云天生物技术有限公司、血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)、类胰岛素生长因子-1(insulinlike growth factors-1，IGF-1)、肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor，HGF)酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自美国ADL公司，Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国pharmingen公司。CO2培养箱购自日本三洋公司，流式细胞仪 (BD-FACSCALIBUR)购自美国BD公司。

脐带MSC的原代培养取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，在超净台内以PBS充分冲洗，除去脐静脉及动脉内的残存血并剔除动静脉血管。将脐带剪成长度约1.0 cm小段，经匀浆处理至1～2 mm大小，置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，在5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。第1次传代后每3 d按1∶3比例传代，进行扩增培养。

脐带MSC的免疫表型分析取第2代脐带MSC，胰酶消化后制成单细胞悬液，分别加入抗人IgG-FITC、CD19-FITC、CD31-FITC、CD34-FITC、CD 90-FITC、 IgG-PE、 CD29-PE、 CD44-PE、 CD45-PE、CD73-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE等单抗各5 μl，以小鼠 IgG1为阴性对照。4℃孵育30 min，采用流式细胞仪进行免疫表型检测。

脐带MSC增殖能力检测采用96孔板，由于96孔板周围1圈容易蒸发，采用弃用周围1圈的办法，改加培养液。每孔加入100 μl(1200个细胞)，每天测5孔，连续测7 d，测前每孔加入10 μl的cck-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1 h。在450 nm测定吸光度。其中以加了相应量培养液但没加入细胞的孔为空白对照组。

脐带MSC的凋亡检测取第2代脐带MSC，采用4℃预冷的PBS洗细胞2次，结合缓冲液重新悬浮细胞，调节浓度至 1×106/ml。取 100 μl细胞悬液于5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V/FITC和 10 μl 20 μg/ml的碘化丙锭溶液，混匀后于室温避光孵育15 min。在反应管中加入400 μl PBS，采用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

脐带MSC细胞周期的检测取第2代脐带MSC，胰酶消化为单个细胞，计数每份标本细胞量达1×106，离心后去上清液，加入-20℃预冷的75%乙醇固定，上机前再次离心去上清液，加入RNA酶去除RNA，加入PI染料4℃避光染色30 min.流式细胞仪检测细胞周期各个时相所占百分比。

脐带MSC细胞内部结构观察取第2代细胞进行培养，待细胞铺满培养瓶后，PBS冲洗，细胞刮子将细胞刮落，1000 r/min(r=18 cm)离心10 min，常规透射电镜标本处理后，在Philip CM-10透射电镜下观察细胞内部的超微结构。

脐带MSC VEGF、IGF-1、HGF分泌水平检测以完全培养基 (含10%胎牛血清的DMEM培养液)作为对照，取2代脐带MSC接种于培养瓶中，每瓶5×105个细胞，换用完全培养基 (含10%胎牛血清的DMEM培养液)培养24 h后，收集细胞培养基，离心后采用ElISA法进行检测。

结 果

脐带MSC的形态观察及生长情况原代培养的脐带MSC为贴壁细胞，培养72 h后，细胞均呈梭形，有胞浆突起，为成纤维细胞样，胞浆丰富，核大，呈平行排列或旋涡状生长，漩涡中心细胞多层分布 (图1)。传代后细胞生长迅速，约3～4 d即可铺满全层。培养细胞可稳定传代。

脐带MSC免疫表型分析结果流式细胞仪分析结果显示，培养的MSC可表达CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、CD90，不表达 IgG、CD19(B细胞抗原)、CD31(内皮细胞抗原)、CD34(造血干细胞抗原)、CD45(白细胞共同抗原)和HLA-DR(MHC-Ⅱ)(图2)。

图1 倒置相差显微镜下原代培养的人脐带间充质干细胞不同时段的形态 (×400)Fig 1 The morphologies of primary human umbilical cord mesenchymal stem cells under inverted phase-contrast microscope(×400)

图2 脐带间充质干细胞的免疫表型分析结果Fig 2 Immunophenotyping results of human umbilical cord mesenchymal stem cells

脐带MSC增殖能力检测结果培养1～2 d，细胞生长较慢，为生长潜伏期;培养3～6 d，细胞生长速度增快，为对数生长期;此后细胞进入生长平台期。在对数生长期中，细胞的倍增时间为 (2.560±0.117)d(图3)。

脐带MSC的凋亡检测结果脐带MSC中正常细胞比例为80.26%，早期凋亡细胞占1.39%，坏死和凋亡细胞占12.56%，死亡细胞占5.80%(图4)。

脐带MSC的细胞周期检测结果脐带MSC中，G0/G1期细胞所占比率为67.48%，S期细胞为32.52%，G2/M期细胞为0(图5)。

图3 人脐带间充质干细胞的生长曲线Fig 3 The growth curve of cultured human umbilical cord mesenchymal stem cells

图4 人脐带间充质干细胞的凋亡比率流式图Fig 4 The apoptosis of human umbilical cord mesenchymal stem cells

脐带MSC的内部结构透射电镜下见脐带MSC呈长梭形，细胞膜完整，细胞表面可见散在的类似微绒毛结构，细胞间连接可见点状桥粒与带状桥粒和紧密连接形成连接复合体。细胞多为单核，偶见双核，核浆比例大，核膜清晰，见核内外膜，外膜外表面附有核糖体，核仁1个或多个，由核仁丝缠绕成海绵球体状，少量的异染色质分布在核周边区，常染色质占多数，是间期核处于伸展部位的染色质，部分细胞可见核仁边集现象。胞浆内可见散在的粗面内质网，具有丰富的游离核糖体，部分细胞可见自噬泡 (图6)。

脐带MSC中VEGF、IGF-1和HGF水平检测结果脐带MSC中的HGF、VEGF和IGF-1水平分别为 (54.760±1.455)pg/ml、(9.029±0.047)ng/ml和 (21.744 ±1.514)pg/ml。

图5 人脐带间充质干细胞的细胞周期流式图Fig 5 The cell cycle composition of human umbilical cord mesenchymal stem cells

讨 论

图6 透射电镜下的人脐带间充质干细胞Fig 6 The ultrastructure of human umbilical cord mesenchymal stem cells under transmission electron microscope

目前，MSC在临床治疗中所起的作用越来越受到重视，但对于如何寻找MSC的理想来源仍是困扰人们的一个难题。脐带是胎儿附属物，来源广泛丰富，从脐带华通胶中提取的MSC取材方便，相对纯净，致瘤性和病毒、细菌污染可能性均较骨髓MSC低，不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫原性低，是一类免疫缺陷细胞［12］，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，且在临床应用上还避免了胚胎干细胞的伦理争议，有望成为临床治疗中的理想种子细胞。因此，本研究从脐带中提取MSC，深入研究了其生物学特性，以期扩展其在临床治疗中的应用。结果发现，脐带MSC细胞形态与骨髓MSC相似，均呈平行排列或漩涡样生长，绝大部分形态类似成纤维细胞。传代细胞2～3 d可增殖1倍，培养细胞可稳定生长传代，细胞增殖活跃，具有较强的自我更新能力。透射电镜也进一步证实其细胞器丰富，核浆比例大，甚至可见多个核仁，表明细胞代谢活跃，分化程度低，且细胞表面见微绒毛，可增加细胞的吸附能力和吸收能力。ELISA检测则证实脐带 MSC能分泌 VEGF、IGF-1、HGF等细胞因子，从而可促进血管内皮细胞的有丝分裂，增加血管通透性，增进单核细胞的趋化性，增加细胞外基质的分泌及抗细胞凋亡。有助于脊髓损伤［13］、缺血性脑卒中［14］、卵巢早衰［4］、组织工程骨的构建［15-16］及肾小球硬化［17］等临床治疗。

［1］Abrams MB，Dominguez C，Pernold K，et al.Multipotent mesenchymal stromal cells attenuate chronic inflammation and injury-induced sensitivity to mechanical stimuli in experimental spinal cord injury ［J］.Restor Neurol Neurosci，2009，27(4):307-321.

［2］Xu C，Su P，Wang Y，et al.A novel biomimetic composite scaffold hybridized with mesenchymal stem cells in repair of rat bone defects models ［J］.J Biomed Mater Res A，2010，95(2):495-503.

［3］Kang EM，Zickler PP，Burns S，et al.Hematopoietic stem cell transplantation prevents diabetes in NOD mice but does not contribute to significant islet cell regeneration once disease is established ［J］.Exp Hematol，2005，33(6):699-705.

［4］Fu X，He Y，Xie C，et al.Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation improves ovarian function and structure in rats with chemotherapy-induced ovarian damage［J］.Cytotherapy，2008，10(4):353-363.

［5］Cilloni D，Carlo-Stella C，Falzetti F，et al.Limited engraftment capacity of bone marrow-derived mesenchymal cells following T-cell-depleted hematopoietic stem cell transplantation ［J］.Blood，2000，96(10):3637-3643.

［6］de Girolamo L，Arrigoni E，Stanco D，et al.Role of autologous rabbit adipose-derived stem cells in the early phases of the repairing process of critical bone defects［J］.J Orthop Res，2010，29(1):100-108.

［7］Blanpain C，Lowry WE，Geoghegan A，et al.Self-renewal，multipotency，and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche ［J］.Cell，2004，118(5):635-648.

［8］Fasouliotis SJ，Schenker JG.Human umbilical cord blood banking and transplantation:a state of the art［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2000，90(1):13-25.

［9］Laslett AL，Filipczyk AA，Pera MF.Characterization and culture of human embryonic stem cells［J］.Trends Cardiovasc Med，2003，13(7):295-301.

［10］Hoffman LM，Carpenter MK.Characterization and culture of human embryonic stem cells ［J］.Nat Biotechnol，2005，23(6):699-708.

［11］Røsland GV，Svendsen A，Torsvik A，et al.Long-term cultures of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells frequently undergospontaneousmalignant transformation［J］.Cancer Res，2009，69(13):5331-5339.

［12］Fu YS，Cheng YC，Lin MY，et al.Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton's jelly to dopaminergic neurons in vitro:potential therapeutic application for Parkinsonism ［J］.Stem Cells，2006，24(1):115-124.

［13］Sharma HS.Neuroprotective effects of neurotrophins and melanocortins in spinal cord injury:an experimental study in the rat using pharmacological and morphological approaches［J］.Ann N Y Acad Sci，2005，1053:407-421.

［14］Miyazawa T，Matsumoto K，Ohmichi H，et al.Protection of hippocampal neurons from ischemia-induced delayed neuronal death by hepatocyte growth factor:a novel neurotrophic factor［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1998，18(4):345-348.

［15］Kanczler JM，Oreffo RO.Osteogenesis and angiogenesis:the potential for engineering bone ［J］.Eur Cell Mater，2008，15:100-114.

［16］Kellner K，Schulz MB，Göpferich A，et al.Insulin in tissue engineering of cartilage:a potential model system for growth factor application ［J］.J Drug Target，2001，9(6):439-448.

［17］Matsumoto K，Nakamura T.Hepatocyte growth factor:renotropic role and potential therapeutics for renal diseases［J］.Kidney Int，2001，59(6):2023-2038.