白细胞分化抗原14基因多态性与严重胸部创伤后并发多器官功能障碍综合征的相关性

刘 云，都定元，胡 旭，向小勇，夏道奎，顾 玮，蒋建新，刘朝兵，覃文超

1三峡大学第一临床医学院胸心外科，湖北宜昌443000

2重庆市急救医疗中心胸心外科，重庆400014

3重庆医科大学附属第一医院胸心外科，重庆400016

4第三军医大学 大坪医院野战外科研究所创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室第四研究室，重庆400042

随着经济的发展，近年来严重胸部创伤 (severe chest trauma，SCT)的发病率居高不下，并处于上升趋势［1］，胸部创伤并发MODS逐渐引起国内外学者的重视。现已明确Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)/白细胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)/髓样分化蛋白 2(myeloid differentiaton protein-2，MD-2)是机体识别革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖 (1ipopolysaccharide，LPS)的关键模式受体，CD14能与 LPS或 LPS结合蛋白 (LPS-binding protein，LBP)结合，介导LPS激活靶细胞，释放多种炎性细胞因子［2］。CD14基因多态性可能在SCT后并发MODS中发挥了重要作用。本研究分析106例SCT患者CD14基因启动子区-1145A/G、-159C/T多态性，探讨其与MODS的相关性。

对象和方法

对象2008年12月至2009年12月在重庆医科大学附属第一医院、重庆市急救医疗中心和第三军医大学附属大坪医院救治的重庆地区SCT患者106例，其中，男81例，女25例，平均年龄 (37.0±12.9)岁。入选标准: (1)致病唯一因素为创伤;(2)符合SCT诊断标准;(3)伤后24 h内入院救治;(4)损伤严重度评分 (injury severity score，ISS)≥16分且胸部简明损伤定级标准 (abbreviated injury scale，AIS)评分≥3分;(5)16≤年龄≤70岁。排除标准:(1)合并有伤后溺水;(2)爆炸伤合并有毒气体吸入;(3)合并药物中毒或氧中毒;(4)原有心血管疾病和慢性肝肾功能障碍史;(5)伤前原有肺部感染治疗未愈或长期慢性肺部疾病史。本研究经重庆市医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

MODS诊断标准(1)呼吸衰竭:呼吸 (respiration，R)＞28/min;血氧分压(partial pressure of oxygen，PaO2)＜6.7 kPa;二氧化碳分压 (partial pressure of carbon dioxide，PCO2)＞5.89 kPa;氧合指数 (fraction of inspired oxygen，FiO2)≤26.7 kPa;胸片显示肺泡实变≥1/2肺野 (具备其中3项或3项以上)。(2)肾功能衰竭:除外肾前因素后，出现少尿或无尿，血清肌酐、尿素氮水平增高，超出正常1倍以上。(3)心功能衰竭:收缩压＜80 mmHg(10.7 kPa)，持续1 h以上;心脏指数 (cardiac index，CI)＜2.6 L/(min·m2);室性心动过速;室颤;Ⅱ度房室传导阻滞;心搏骤停复苏后 (具备其中3项或3项以上)。(4)肝功能衰竭:总胆红素＞34 μmol/L;肝脏酶较正常升高2倍以上;凝血酶原时间＞20 s;有或无肝性脑病。(5)弥散性血管内凝血 (disseminated intravascular coagulation，DIC):血小板＜100×109/L;凝血酶原时间和部分凝血酶原时间延长1.5倍，且纤维蛋白降解产物增加;全身出血表现。(6)脑衰:Glasgow评分低于8分为昏迷，低于3分为脑死亡。［3］

临床资料分析器官功能评分参照Marshall等［4］的方法评定，按照简明损伤定级标准 2005(AIS-2005)［5］进行胸 AIS、ISS 评分。

血标本收集及处理取静脉全血5 ml，ACD血液抗凝液 (柠檬酸4.8 g，柠檬酸钠13.2 g，葡萄糖14.7 g，三蒸水至1000 ml)(1∶6)抗凝。3000 r/min(r=25.4 cm)离心5 min后，吸取红细胞和血浆间的淡黄层物质，放入EP管中，－70℃冻存待用。

基因组DNA提取采用酚氯仿方法提取基因组DNA。

PCR扩增上下游PCR引物分别:-1145 G→A(P1:5'-GGC AAC AGA GCC AAA CTC AG-3'和P2:5'-GCC CTC CCC TCA GTA CAA TC-3')，-159 T→C(P1:5'-GTG CCA ACA GAT GAG GTT CA-3'和P2:5'-GCT TCC AGG CTT CAC ACT TG-3')。由上海生工生物技术有限公司合成。反应体系包括1 μl基因组DNA，2.5 μl 10 ×缓冲液，0.2 mmol/L dNTPs，反向引物和正向引物各1.0 μmol/L，TaqDNA聚合酶1 U，不足体积用灭菌双蒸水补充至25 μl，所有试剂均为宝生物 (大连)技术有限公司产品。PCR反应循环参数为:94℃预变性 5 min;94℃变性30 s，56℃作用40 s，72℃作用40 s，30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物8 μl，分别加HpyCH4 V、AvaⅡ内切酶1 U，10×Buffer 1.5 μl，37℃酶切 2 h。酶切产物于含有溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳40 min后，自动凝胶成像分析系统进行成像和分析。如果-1145位点是G/G，只产生296 bp大小1条扩增条带;如果是A/A，则产生208和88 bp 2条扩增条带;如果是G/A，则产生296、208、88 bp 3条条带;如果-159位点是C/C，只产生592 bp大小1条扩增条带;如果是T/T，则产生355和237 bp两条扩增条带;如果是C/T，则产生592、355、237 bp 3条带。分型结果由两人独立判读，并随机抽取10例标本通过直接测序方法验证。

统计学处理采用SPSS 17.0统计软件，等位基因频数通过计数获得，采用卡方检验;基因多态性与MODS评分的关系采用单因素方差分析和线性回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一般情况106例SCT患者中，47例合并MODS，59例无 MODS;两组在年龄 ［(37.1±13.7)岁比 (36.9±13.7)岁，P=0.839］、男女性别比 (34/13比 47/12，P=0.752)、ISS评分［(3.46±0.58)分比 (3.43±0.71)分，P=0.744］方面差异均无统计学意义。

CD14-1145 G→A与SCT后MODS的相关性3种基因型在MODS组和非MODS组中的频率分别为GG型:21/47和14/59;GA型:21/47和34/59;AA型:5/47和11/59;G等位基因携带者并发MODS的可能性明显高于A等位基因携带者 (OR=0.545，95%可信区间为0.030～0.037，P=0.033)。单因素方差分析结果显示，-1145G等位基因携带者的MODS评分明显高于A等位基因携带者 (隐性遗传模式P=0.037，显性遗传模式P=0.217)。回归分析结果显示，MODS评分与等位基因型呈线性相关(P=0.043)(表1)。

CD14-159 T→C与SCT后MODS的相关性3种基因型在MODS和非MODS组中的频率分别为TT型:13/47和 13/59;TC型:26/47和 34/59;CC型:8/47和12/59;T等位基因携带者并发MODS的可能性与C等位基因携带者差异无统计学意义 (P=0.517)。单因素方差分析结果显示，-159T等位基因携带者的MODS评分明显高于C等位基因携带者(显性遗传模式 P=0.048，隐性遗传模式 P=0.198)。回归分析结果显示，MODS评分与等位基因型呈线性相关 (P=0.046)(表1)。

两个位点的联合作用两个位点同时发生突变与只有1个位点发生突变的患者相比 (GA-TC+AACC+GA-CC+AA-TC比GG-TC+GG-CC+AA-TT+GA-TT)，MODS发生率差异有统计学意义 (P=0.008)，MODS评分差异无统计学意义 (P=0.239);两个位点均为突变型纯合子的患者与杂合子携带者患者相比 (AA-CC比GA-TC+GA-CC+AA-TC)，MODS评分 (P=0.263)及MODS发生率 (P=0.189)差异均无统计学意义 (表2)。

讨 论

SCT在创伤致死的原因中占第2位，仅次于颅脑损伤［6］;胸部创伤直接导致的死亡占创伤死亡的25%，其引起的并发症与另外25%的死亡有关［7］。胸部创伤并发MODS时，病情危重、复杂、变化大、缺乏特异性诊断方法、救治难度高，文献报道MODS的病死率高达57% ～95%［8］。一旦并发包括序贯性多器官衰竭，病情将很难逆转［9］。随着人类基因组研究的进展，人们已经认识到不同的基因背景可以造成不同人群对于某些疾病存在不同的易感性。通过遗传背景确定多基因、多因素影响疾病的易感性是目前医学研究的热点之一［10］。研究SCT后MODS的易感机制，可为寻求有效的预防、治疗方案带来希望。

表1 CD14基因多态性与MODS的相关性Table 1 Correlation between CD14 gene promoter polymorphisms and MODS

表2 -1145G/A与-159T/C的联合作用Table 2 Synergy of-1145 and-159 SNPs in patients with severe chest trauma

CD14基因位于第5号染色体的长臂5q23-31区，长约3900bp，编码含有375个氨基酸的糖蛋白。CD14作为LPS的受体，主要表达在单核巨噬细胞表面，可通过脂多糖结合蛋白与LPS特异性结合，并通过Toll样受体向下游传递活化信号，启动单核巨噬细胞系统，并释放多种前炎性细胞因子，从而参与炎性反应。过度炎症反应被认为是严重创伤后MODS发生的重要机制之一［11］，而 CD14已知在这一过程中发挥着重要作用［12］。CD14基因具有遗传多态性，这种基因多态性影响CD14的基因转录，进而影响到CD14的生物学功能。因而，笔者推测CD14基因多态性可能与MODS的易患性有关。既往研究发现，CD14基因启动子区存在多个单核苷酸多态性，在不同人群中分布也有不同［13］。其中，研究最多且被认为与各种疾病相关性最大的是CD14基因启动子区-159C/T［14］;而关于启动子区-1145A/G的相关报道较少。近年来，越来越多的研究显示，模式识别受体基因多态性与包括MODS在内的一系列综合征的易感性及结局有关［15］。本研究对106例SCT患者CD14基因启动子区-1145 A/G、-159C/T位点进行了分型，并分析其与创伤后MODS评分、MODS易感性的关系，结果显示:-1145 A/G携带G等位基因型的创伤患者并发MODS的可能性明显高于A等位基因携带者，CD14-1145G等位基因携带者MODS评分明显高于A等位基因携带者，CD14-1145G等位基因携带者MODS评分明显高于A等位基因携带者，MODS评分与-1145 A/G、-159C/T等位基因型呈线性相关。在单个位点关联研究的基础上，本研究分析了两个位点不同组合与MODS的相关性，结果发现:同时携带两个突变等位基因与只携带一个突变等位基因的患者相比，MODS评分显著降低，表明CD14基因启动子区-1145 A/G、-159C/T可能是重要的严重创伤后并发症发生的危险因素。

［1］Rendon F，Gomez-Danes LH，Castro M.Delayed cardiac tamponad after penetrating thoracic trauma ［J］.Asian Cardiovasc Thorac Ann，2004，12(2):139-142.

［2］Dziarski R，Gupta D.Peptidoglycan recognition in innate immunity ［J］.Endotoxin Res，2005，11(5):304-310.

［3］孙加源，施梦，李银平，等.中国多器官功能障碍综合征研究进展 ［J］.中国危重病急救医学，2007，19(3):189-192.

［4］Marshall JC，Cook DJ，Christou NV，et al.Multiple organ dysfunction score:a reliable descriptor of a complex clinical outcome ［J］.Crit Care Med，1995，23(10):1638-1652.

［5］美国机动车医学促进会/重庆市急救医疗中心.简明损伤定级标准2005［M］.重庆:重庆出版社，2005.

［6］Peden M，Scurfidd R，Sleet D，et a1.World report on road traffic injury prevention［M］.Genera:WHO，2004:3-5.

［7］Keel M，Trentz O.Pathophysiology of polytrauma［J］.Injury，2005，36(6):691-709.

［8］王超.多器官功能障碍综合征病死率 ［J］.临床和实验医学杂志，2006，5(2):43-44.

［9］石应康.胸部创伤临床研究进展 ［J］.中华创伤杂志，2007，23(10):793-795.

［10］Risch NJ.Searching for genetic determinants in the new millennium ［J］.Nature，2000，405(6788):847-856.

［11］Kaczorowski DJ，Mollen KP，Edmonds R，et al.Early events in the recognition of danger signals after tissue injury［J］.J Leukoc Biol，2008，83(3):546-552.

［12］Phan HH，Cho K，Sainz-Lyon KS，et al.CD14 dependent modulation of NF-kappaB alternative splicing in the lung after burn injury ［J］.Gene，2006，371(1):121-129.

［13］Gazouli M，Manieai G，Kotsinas A，el a1.Association between polymorphisms in the Toll-like receptm-4，CD14，and CARD15/NOD2 and inflammatory disease in the Greek population ［J］.World J Gastmenterol，2005，11(5):681-685.

［14］Klausz G，Molnár T，Nagy F，et a1.Polymorphism of the heat-Shock protein gene Hsp70-2，but not polymorphisms of the IL-10 and CD14 genes，is associated with the outcome of Crohn's disease ［J］.Stand J Gastroenterol，2005，40(10):1197-1204.

［15］Sadée W，Dai Z.Pharmacogenetics/genomics and personalized medicine ［J］.Hum Mol Genet，2005，2:R207-R214.