枸杞果酒中总黄酮含量的发酵条件优化

许 亮，师俊玲,*，陈东方，王振平

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.宁夏大学 葡萄与葡萄酒教育部工程研究中心，宁夏 银川 750021)

枸杞果酒中总黄酮含量的发酵条件优化

许 亮1，师俊玲1,*，陈东方1，王振平2

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.宁夏大学 葡萄与葡萄酒教育部工程研究中心，宁夏 银川 750021)

以宁夏枸杞为原料，通过Box-Behnken试验设计研究发酵温度、糖添加量、酵母添加量及pH值对发酵后枸杞果酒中总黄酮含量的影响，建立各影响因素的回归方程，并通过响应面分析法优化出成品酒中总黄酮含量的最佳发酵条件为：发酵温度21.9℃、酵母添加量0.29g/L、糖添加量107.0g/L、pH4.3，此条件下的预测值为0.2404g/L，实测值为(0.2337±0.0043)g/L，表明所得模型有很好的预测性。

宁夏枸杞；果酒；发酵；总黄酮；响应面；优化

枸杞(Lycium barbarum)是中国重要的药食两用植物之一[1-2]。中国有7个枸杞品种，主要分布在宁夏、新疆、内蒙古、青海、山西和河北等地，其中以宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)最为有名。枸杞果实除了具有水果的基本营养成分以外，还含有总黄酮类化合物、多糖等生物活性物质[3]。枸杞总黄酮具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能[4-7]。枸杞酒是枸杞的传统食用方式之一。枸杞酒的加工方法主要有浸泡法和发酵法两种。浸泡法是将枸杞用高度酒进行浸泡，所得枸杞酒的营养物质少，酒度高，适用人群少；发酵法是通过微生物发酵法生产果酒，能够更多地保留枸杞果实中的营养成分，酒精体积分数较低，适用人群广[8-9]。不适宜的加工条件会导致原料中活性成分含量降低或失去活性。目前有关枸杞果酒发酵过程的研究都侧重于提高产品风味和感官特性[10-11]，而针对提高酒中活性成分含量的发酵过程优化的研究尚未见报道。果酒中活性物质的最终含量不仅与原料品质有关，而且与该物质在果酒体系里溶解度、发酵周期和发酵条件等因素有关，不适宜的加工过程和过长的发酵时间都会导致物质的活性或含量降低。

通过控制最适的发酵过程和发酵周期来提高成品酒中总黄酮含量，对于提高枸杞酒的营养与保健功能具有重要意义。根据果酒的发酵特点和主要的影响因素，本研究重点考察发酵温度、糖添加量、酵母添加量和料液pH值对发酵后果酒中总黄酮含量的影响规律，通过单因素试验和Box-Behenken试验，结合响应面分析方法(RSM)对能够提高成品酒中总黄酮含量的发酵条件进行优化，进而得出使枸杞果酒中含有最大量总黄酮的发酵条件，为进一步提高枸杞果酒营养价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞 宁夏中宁天宝商贸有限公司(含水量10.7%，使用前在冷库中密闭保存，用时拿出)。

酵母Excellence SP 法国Lamothe-Abiet公司；芦丁标准品 中国药品生物制品检定所；NaHSO3、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1700型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；电子恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；ZSD-1160培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司；MST-303搅拌机 广东省中山市美斯特电器有限公司；T-203电子天平 美国丹佛公司；PH-3C雷磁精密pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞果酒发酵工艺流程

枸杞→以料液比1:10(m/V)用自来水(pH6.7)浸泡30min→打浆→调整成分(白砂糖、酒石酸、NaHSO3)→接种酵母→发酵→离心→果酒样品

打浆：将浸泡后的枸杞用搅拌机(13000r/min)搅拌破碎30s成浆；调整成分：按照实验设计，用白砂糖调整枸杞浆液的糖度，用酒石酸调整酸度，并加入SO2(以NaHSO3计)抑制杂菌和防止氧化；发酵：接入酵母后在实验设计的温度下静置发酵4～8d，至发酵液中残糖含量不再变化为发酵结束；离心：发酵结束后，及时对发酵液进行离心处理(4000r/min离心5min)，取上清液测定酒中总黄酮含量。

1.3.2 总黄酮含量的测定

参照文献[12-13]所述方法，测定样品的总黄酮含量。以总黄酮质量浓度ρ(mg/100mL)为纵坐标，吸光度A为横坐标绘制标准曲线，可得回归方程：ρ=6.0008A＋0.0997(R2=0.9995)。

取5.0mL总黄酮样品液，按照标准方法测吸光度，根据标准曲线所得回归方程计算样品中总黄酮含量。

1.3.3 发酵条件的单因素试验设计

取30g枸杞按料液比1:10于室温下浸泡30min，打浆，加入162.5mg/L亚硫酸氢钠，根据单因素试验设计，在维持其他条件不变的条件下，分别改变发酵温度、糖添加量、酵母添加量和发酵液初始pH值，分别考察各因素对成品酒中总黄酮类化合物的影响情况。在单因素试验中，改变一个因素时，其他因素的水平分别固定为：糖添加量0(此时发酵醪的含糖量为113.0g/L)，初始pH4.0，酵母接种量0.2g/L，发酵温度20℃。各因素的变化范围分别为：发酵温度：15.0、17.5、20.0、22.5、25.0、30.0℃；发酵液初始pH值：3.0、4.0、5.0、6.0；糖添加量：0、50.0、100.0、150.0、200.0g/L；酵母添加量：0.1、0.2、0.3、0.4g/L。

发酵结束后，按照方法1.3.1节中相关步骤处理，取上清液测定其中总黄酮含量。

1.3.4 发酵条件的Box-Behnken试验设计

根据单因素试验结果并结合已有文献[14]报道，选取发酵温度、糖添加量、酵母添加量、初始pH值4个因素，按照Box-Behnken设计进行试验，设计四因素三水平试验。所选因素的水平及其编码值见表1。

表1 Box-Behnken试验设计的因素水平编码值Table 1 Coded factors and their coded levels in Box-Behnken matrix design

2 结果与分析

影响枸杞酒中总黄酮含量的主要过程有两个：一是原料中总黄酮的提取，二是提取液中总黄酮的稳定。已有研究表明，影响总黄酮提取效果的主要因素有乙醇体积分数、提取时间、提取温度[12]；影响溶液中总黄酮稳定性的主要因素有pH值、还原剂、金属离子、自然光[15]；影响果酒发酵过程中总黄酮稳定性的主要因素有菌种、温度、接种量、SO2、自由基、pH值、金属离子等[16]。枸杞酒发酵过程中，除了温度控制恒定以外，发酵液中的pH值和酒精体积分数则随着微生物的生长代谢而处于一种变化的状态。其中，糖添加量和酵母添加量会影响菌种的生长代谢速度和最终的乙醇产量，温度会影响菌种的生长和乙醇的产生速度，低pH值有助于抑制其他杂菌的污染和保证发酵过程的正常进行，酵母添加量会影响发酵过程的起始速度和发酵速度。为了掌握发酵过程酒液中总黄酮含量的变化规律，本实验重点考察不同温度、pH值、接种量和含糖量条件下果酒中总黄酮含量的变化。

2.1 单因素试验结果

2.1.1 糖添加量的影响

图1 糖添加量对枸杞果酒中总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of sugar addition on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine

为了调整发酵醪的糖度以保证产生足够的酒度，需要在枸杞汁中加入一定量的糖。由图1可知，发酵液中糖添加量从0增大至200.0g/L时，成品酒中总黄酮含量呈先上升后下降的趋势，在糖添加量为100.0g/L时达到最大值。糖添加量对酵母的生长代谢会产生重要影响，进而影响到发酵果酒中总黄酮的存在；同时糖添加量的不同会造成发酵后的果酒酒精体积分数不同，总黄酮的溶解度在不同酒精体积分数中有所不同，这也会造成枸杞果酒中总黄酮含量有所变化。本试验表明，糖添加量100.0g/L有利于酵母的生长，同时此条件下最终枸杞果酒酒精体积分数14%是枸杞中黄酮溶出的适宜酒精体积分数。

根据已有报道，总黄酮类化合物对葡萄糖、淀粉、蔗糖较稳定[15]。因此，糖添加量对酒中总黄酮含量的影响主要在于其对酵母生长和代谢的影响。糖质量浓度适宜时酵母的生长速度快，发酵起动得早，菌体生长旺盛，乙醇产生速度快；代谢速度较快；糖质量浓度持续增加时，酵母的生长和代谢反而会受到抑制，甚至会停止发酵[17]。另外，发酵液的含糖量高，成品酒的酒精体积分数高；含糖量低，转化成的酒精体积分数也低。孔令明等[18]研究表明，在较低酒精体积分数范围内，总黄酮的溶出率随酒精体积分数的增加而升高，这与本研究结果相符。在糖添加量为200.0g/L时总黄酮含量降低，则可能是过高的糖质量浓度抑制了酵母的生长与代谢，酒精产量低。

2.1.2 发酵温度的影响

图2 发酵温度对枸杞果酒中总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of temperature on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine

温度对于总黄酮的提取率、稳定性及酵母菌的生长代谢都有重要影响。高温虽然有利于总黄酮的提取，而且对总黄酮的稳定性无显著影响[19]，但会抑制酵母的生长与代谢，从而影响酒中的乙醇含量。参考果酒发酵的温度范围，本试验重点考察了当发酵温度分别控制在15～30℃范围内的不同水平时，所得成品酒中的总黄酮含量。由图2可知，随着发酵温度的增大，成品酒中总黄酮含量呈先增大后降低趋势，20℃时达到最大值。与发酵液中糖添加量的影响相似，发酵温度同样会影响到酵母的生长代谢以及总黄酮的溶解度，进而造成发酵后枸杞果酒中总黄酮含量的不同，选用20℃为酵母的最佳发酵温度，同时是黄酮溶出的适宜温度。

根据酵母的生长特性可知，20℃为酵母最适繁殖温度[20-21]。温度过低时，酵母生长和代谢速度缓慢，短期内的酒精产量低，但最终生成的酒精体积分数高；随着温度的升高，酵母的生长和代谢速度增强，短期内的酒精产量高，但最终生成的酒精体积分数并不一定高；温度过高时，发酵速度虽然快，但发酵停止得早，酵母衰老更快，产品酒度低，从而使总黄酮苷的含量反而低。余晓红等[22]在研究啤酒发酵过程时发现，主发酵温度为13℃时，酵母的生长量、发酵度和高级醇产量等均高于9℃。而靳桂敏等[16]在研究岗稔果酒的发酵过程时发现，控制发酵温度为13℃时所得酒中总黄酮含量高于30℃时所得结果。由于本研究中是短期定时取样，20℃表现为最佳发酵温度主要是因为该温度是酵母的最适生长温度，能够在短期内产生较多的酒精，从而有利于提高酒中总黄酮的溶解率，而又保持较好的稳定性。

2.1.3 酵母添加量的影响

由图3可知，酵母添加量从0.1g/L增加到0.4g/L时，成品酒中总黄酮含量呈先增大后减少趋势，在酵母添加量为0.2g/L时达到最大值。这是因为，发酵液中糖含量和发酵温度一定时，酵母添加量少，发酵起动慢，容易污染杂菌，短期内产酒精量低；酵母添加量大，发酵启动早、速度快，短期内产酒精量高；酵母添加量过大时，酵母新增细胞数少、容易老化，酒精产量少[23]。靳桂敏等[16]也发现，在岗稔果酒的发酵过程中，酵母添加量对酒中总黄酮含量也表现出相同的影响规律。

图3 酵母添加量对枸杞果酒中总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of yeast inoculation size on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine

2.1.4 发酵液pH值的影响

图4 pH值对枸杞果酒中总黄酮含量的影响Fig.4 Effect of pH on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine

自然枸杞汁的pH值为6.0左右。考虑到杂菌污染的影响，在发酵前都需要降低其pH值，从而抑制发酵过程中产生的杂菌污染；但是，过高的酸度也会抑制酵母的生长，并且会使果汁内一些物质如乙酸乙酯发生水解生成挥发酸进一步影响发酵液pH环境[17,23-24]。由图4可知，枸杞汁的pH值从2.0增大至6.0时，成品酒中总黄酮含量呈现先增大后降低的趋势，在pH4.0时达最大值，这说明枸杞中总黄酮在pH4左右的条件下比较稳定。

就物质结构而言，总黄酮是一类含有酚羟基的化合物，呈酸性[25]。pH值对总黄酮的稳定性有重要影响。张雁[26]和王辰[27]等发现多数总黄酮在pH4～5时较稳定；张久春等[15]报道，柑橘皮中水溶性总黄酮pH5～6条件下比较稳定，在强酸和强碱溶液中不稳定。这些结果均与本实验的研究结果基本一致。

2.2 Box-Behenken试验结果

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken matrix design scheme and corresponding experimental results

表3 二次响应面回归模型方差分析和模型系数显著性检验Table 3 Analysis of variance of quadratic regression model and significance test for its each term

为了考察各因素对成品酒中总黄酮含量的综合影响，按照Box-Behenken设计进行试验，结果见表2。对其中试验数据使用Design-Expert 7.00进行分析并推导得出以总黄酮含量为因变量的函数关系：优化参数系数，因素A(温度)、D(pH值)以及所有因素的平方项对总黄酮终含量有显著影响。分析表明，温度和酵母添加量以及酵母和糖添加量之间也有相互作用。忽略到影响较小的因素，得到预测模型如下：

总黄酮含量/(g/L)＝0.2364＋0.0138A＋9.083×10-4B＋2.375×10-3C＋9.583×10-3D－8.800×10-3AB＋9.325× 10-3BC－0.019A2－0.018B2－0.013C2－0.018D2

对上述方程及其系数进行方差分析，结果如表3所示，回归模型方差分析结果表明，F值为27.4284，只有不到0.1%的可能是扰动项造成，表明该模型显著。模型的各因素中，A、D、A2、B2、C2、D2达到了极显著水平；交互项AB、BC达到了显著水平，失拟(P=0.7781＞0.1)不显著，结果表明二次项模型拟合试验数据的效果是显著的。模型R2=0.9384表明仅有6.2%变异的不能由该模型解释，调整后R2=0.9042证明该模型具有较高价值；同时变异系数(2.76%)也较低，表明该试验具有很高的精确度和可靠性。

由回归方程中各因素的回归系数的绝对值大小可以看出，各因素一次项对总黄酮含量的影响次序为A＞D＞C＞B，即温度的影响最大，糖添加量的影响最小。

图5 内学生化残差正态概率分布图Fig.5 Normal plot of internally studentized residuals

图5为拟合模型的内学生化残差分布，其残差各点分布几乎在一条直线上，表明该模型拟合效果较好。同时对比预测值与实际值之间相互关系，结果显示，预测值和实际值的分布也基本在一条直线上，表明模型具有较好的实际作用。

图6 温度和酵母添加量交互作用等高线示意图(a)和响应曲面图(b)Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of yeast inoculation size and temperature on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine

图7 酵母添加量和糖添加量交互作用的等高线示意图(a)和响应曲面图(b)Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of yeast inoculation size and sugar addition on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine

由图6a、7a可以看出，当温度水平较低时，随着酵母添加量的增加，总黄酮含量随之增加；当温度水平较高时，总黄酮含量随酵母添加量的增加反而下降。在温度处于20.0～22.5℃、酵母添加量在0.25～0.35g/L范围时总黄酮含量有最大值。图6b、7b显示了温度和pH值处于零水平时酵母添加量和糖添加量的交互作用，总黄酮含量随着酵母、糖添加量的增加都是先升高后下降的趋势，与单因素试验结果相符。酵母添加量处于0.25～0.3g/L、糖添加量在50～100g/L范围内时，酒中总黄酮含量有最大值。

由图6 b、7 b可知，拟合曲面有最大值，利用Design-Expert对回归模型求解，得到发酵酒中总黄酮含量达到最大时，最佳条件为发酵温度21.9℃，酵母添加量0.29g/L，糖添加量107.0g/L，pH4.3，此条件下总黄酮最终含量达到最大为0.2404g/L。在优化得出的最佳条件下进行验证实验，实际结果为(0.2337±0.0043)g/L，验证了响应面模型，结果表明实验值和预测值吻合，说明利用响应面分析发酵果酒中总黄酮最终含量可信，该模型得到的发酵参数可靠，可以用来反映预测值，具有实用价值。

3 结 论

在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behnken试验方案考察了发酵温度、糖添加量、酵母添加量以及初始pH值对发酵后枸杞果酒中总黄酮含量的影响；利用响应面分析方法建立了各因素对枸杞果酒中总黄酮含量的二次多项式模型，对模型进行了方差分析，结果表明：模型拟合程度高、试验误差较小。研究为以保留枸杞中活性因子总黄酮为目标的果酒发酵提供了一定的参考资料。

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Optimization of Fermentation Conditions for Production of Chinese Wolfberry Fruit Wine with Higher Total Flavonoid Content

XU Liang1，SHI Jun-ling1,*，CHEN Dong-fang1，WANG Zhen-ping2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；
2. Engineering Research Center of Grape and Wine, Ministry of Education, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

This study aimed to develop a fermentation process for the production of fruit wine using Chinese wolfberry fruits from Ningxia autonomous region as the starting material. The fermentation conditions temperature, sugar addition, yeast inoculation size and pH were investigated in 4 runs of single factor experiments to preliminarily understand their effects on total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine. Subsequently, Box-Behnken matrix design followed by regression analysis was used to establish a quadratic regression model for total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine as a function of the above four fermentation conditions. Finally, response surface analysis was carried out for optimization purpose. The optimum fermentation conditions for improved total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine were determined as follows: fermentation temperature 21.9 ℃; yeast inoculation size 0.29 g/L; sugar addition 107.0 g/L; and pH 4.3. Under these conditions, the predicted value of total flavonoid content in Chinese wolfberry fruit wine was 0.2404 g/L, and the experimental value was (0.2337 ± 0.0043) g/L. Therefore, the established regression model has good prediction ability.

Chinese wolberry；fruit wine；fermentation；flavonoids；response surface methodology；optimization

TS262.7

A

1002-6630(2011)07-0188-06

2010-08-07

国家自然科学基金项目(20862014)

许亮(1989—)，男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：muzxl2007@gmail.com

*通信作者：师俊玲(1972—)，女，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：sjlshi2004@yahoo.com.cn