甘肃省汉族、回族人非综合征唇腭裂与转化生长因子-α的基因多态性相关性研究

张志瑞，陈莉娅，任卫萍，杨 芒

（1.兰州大学第一医院口腔科，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院口腔科，甘肃 兰州 730000）

甘肃省汉族、回族人非综合征唇腭裂与转化生长因子-α的基因多态性相关性研究

张志瑞1，陈莉娅1，任卫萍2，杨 芒1

（1.兰州大学第一医院口腔科，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院口腔科，甘肃 兰州 730000）

目的研究甘肃省汉族和回族人非综合征唇腭裂与转化生长因子-α（Transforming Growth Fator-α，TGF-α）基因多态性的相关性。方法 采用聚合酶链反应——限制性酶切片段长度多态（PCR-RFLP）的方法对50例汉族非综合征唇腭裂患者与25例正常汉族人，50例回族非综合征唇腭裂患者与18例正常回族人进行TGF-α基因检测分析。结果甘肃省汉族、回族非综合征唇腭裂（NSCL/P）患者的C2等位基因频率较正常人明显增高，2组比较有显著性差异（P<0.05），汉族和回族人NSCL/P患者等位基因频率、基因型均无显著性差异。结论TGF-α基因多态性与甘肃省汉族、回族人群非综合征唇腭裂的发生有关联。

甘肃省汉族、回族人；非综合征唇腭裂；转化生长因子-α；基因多态性

唇腭裂是口腔颜面部最常见的发育畸形，常伴发牙颌系统畸形，是一种复杂的、由遗传和环境因素相互作用所致的多基因、多因素遗传病。而非综合征唇腭裂（NSCL/P）是指不伴有全身其他疾病的单纯的唇裂或腭裂与唇裂伴腭裂。国内外研究证明，遗传因素在非综合征唇腭裂的发病因素中占有举足轻重的地位。由于唇腭裂病因的复杂性、遗传模式的不确定性、不同地区甚至不同表型NSCL/P的候选基因存在差异，有大量的研究数据表明，唇腭裂的发生存在人种、地域的差异。

本研究通过采用聚合酶链反应——限制性酶切片段长度多态（PCR-RFLP）的方法，对甘肃省50例汉族非综合征唇腭裂患者与25例汉族正常人，50例回族非综合征唇腭裂患者与18例回族正常人进行TGF-α的研究，进一步探究TGF-α基因与甘肃省汉族、回族人群非综合征唇腭裂发生的相关性。

1 材料和方法

1.1主要试剂和仪器

PCR扩增试剂盒（天根生物公司生产），限制性内切酶、耐热DNA多聚酶、DNA Marer、琼脂糖为Promega公司产品，血液DNA提取试剂盒及淋巴细胞分离液（均购自上海生工生物公司），TGF-α基因TaqI限制性片段多态性特异性PCR扩增引物[1]，上游引物为：5’-TCA CTTCCC CTT TTTCATCTG-T-3’，下游引物为：CGA GGA GGC TCTGAG GTG-3’。Gerpro凝胶自动分析和成像系统、ABI9700PCR扩增仪（美国制造），水平离心机（北京医学离心机厂制造），Heraeus低温高温离心机（德国制造）。

1.2 病例选择

非综合征唇腭裂患者均为在甘肃省内长期居住并参加了兰州大学第一医院口腔颌面外科“微笑行动”与“微笑列车”活动的患者。选取汉族、回族单纯唇裂或单纯腭裂或唇裂合并腭裂的非综合征患者为实验组，年龄3个月～18岁。对照组均为相应民族正常人志愿者，参试者均在知情同意下进行，且无系统性疾病，近期未服用药物。

1.3 方法

所有参试者抽取外周血3m l加EDTA抗凝后，严格按照纯化试剂盒的操作说明提取DNA，用核酸分析仪进行DNA的定量，稀释后备用。反应体系：PCR总反应体系25μl，其中含待测模板1μl，dNTP 2.5μl，TaqDNA聚合酶1μl及其相应的10xbuffer2.5μl，上、下游引物各1μl，用去离子水补足14μl，2xTapPCR Mastermix（Mgcl2，dNTP，Taq 酶，缓冲液 ）放入 PCR扩增仪内，93℃预变性 3min，93℃变性 30 s，54.5℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，10 个循环，然后 93℃变性 30 s，54.5℃退火 30 s，72℃延伸30 s，22个循环，最后72℃延伸 10min。取PCR产物10μl，加TaqI限制性内切酶8 U及相应的10xbuffer 2μl，0.1%BSA 2μl，65℃水浴酶切6 h以上。电泳分析酶切产物，取15μl酶切产物上样，在4%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察结果，确定个体的基因型。

1.4 统计学分析

采用SPSS11.0统计软件处理数据，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 TGF-α基因型分析

PCR扩增产物为一条178 bp（174 bp）片段，经过TaqI酶切后可产生 2条片段（122 bp和 52 bp），3种基因型：（1）C1C1型（正常纯合子），仅有178 bp一条片段且不能被酶切；（2）C1C2型（杂合子），酶切后产178 bp、122 bp和52 bp 3条片段；（3）C2C2型（突变纯合子），产生122 bp及52 bp 2条片段。

2.2 TGF-α/Taq I基因多态性（见表1）

表1 实验组与对照组TGF-α的等位基因与基因型的分布频率

根据电泳结果确定被检测人员的基因型及基因频率，如表1所示，汉、回族实验组与对照组的TGF-α等位基因C2频率比较有显著性差异（P＜0.05），而汉、回族人群非综合征唇腭裂组等位基因频率无显著性差异（P＞0.05），C1C1、C1C2、C2C2 基因型频率无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

近年来研究表明，新生儿畸形率呈上升趋势，而唇腭裂畸形发生率上升较为迅速，我国的发病率为0.182%[1]。尽管其发病因素不明确，但遗传和孕期环境因素是目前公认的发病原因，其中基因的多态性变异成为主要的致病因素。TGF-α是一种生长因子，属于表皮生长因子家族，能刺激上皮细胞的增生并诱导其分化，对许多细胞的生长具有调节作用。在小鼠发育的腭突中，TGF-α得以广泛表达，该基因可刺激腭突细胞合成细胞外基质，对腭突的生长、上抬和融合都有重要的作用[2]。1989年，Ardinger等[3]首次以高加索人群为研究对象，发现TGF-α基因多态性与非综合征唇腭裂有显著的关联，而Yasushi等[4]的研究也发现，该基因的多态性与NSCL/P的发生存在相关性；Lidra等[5]对菲律宾人群的研究发现，TGF-α与NSCL/P的发生无关联，国内学者袁奎封[6]的研究表明，TGF-α可能与山东汉族人非综合征唇腭裂的发生有关，由此可见，TGF-α基因在非综合征唇腭裂发生中的作用存在人群特异性。本研究采集汉族、回族非综合征唇腭裂患者及相应民族的健康人对照，分别抽取其外周血，通过分子生物学PCR的方法，分析位于2号染色体上的基因位点[7]——TGF-α与甘肃省汉族、回族人群非综合征唇腭裂有显著关联，而在甘肃省汉族、回族人群非综合征唇腭裂患者之间无显著性差异，这说明TGF-α可能是甘肃省汉族、回族人群非综合征唇腭裂患者的候选基因，但在汉、回族之间并无特异性的选择，这将为我们今后对唇腭裂发生的候选基因的探究提供参考依据。

[1]史晓泓，唐慧，梁怡.新生儿唇腭裂畸形的致病因素研究进展[J].中国妇幼保健，2006，21（7）：1006～1007.

[2]Dixon MJ，Garaner J，Ferguson MWJ.Immunolocalization of epidermal growth fator（EGF），EGF receptor and transforming growth factor alpha（TGF-a）duringmurine palatogenesis in vivo and in vitro[J].Anat Embryol，1991（18）：83～91.

[3]Ardinger HH，Buetow KH，Bell GI，et al.Association of genetic variation of the transforming growth factor alpha gene with cleft lip and palate[J].Am JHum Genet，1989（45）：348～359.

[4]Yasushi S，Peter A，Jezewski M，et al.In a vietnamese population，MSX1 Variants contribute to cleft lip and palate[J].Genet Med，2004，6（3）：117～125.

[5]Lidral AC，Murray JC，Buetow KH，et al.Studies of the candidate genes TGFB2，MSX1，TGA，andTGFB3 in the etiology of cleft lip and palate in the philippines[J].Cleft Palate Craniofac J，1997（34）：1～6.

[6]袁奎封.转化生长因子-α基因多态性与山东汉族人非综合征性唇腭裂的关系[J].华西口腔医学杂志，2006，24（6）：533～535.

[7]徐滨.染色体基因位点与非综合征性唇腭裂致病机制的关系[J].国际口腔医学杂志，2007，34（5）：348～351.

R195

B

1671-1246（2011）16-0104-02

Vol.29 2011 No.16

兰州大学青年基金资助项目（2010-1-12）