四种淡水鱼致敏蛋白免疫原性研究

刘楚怡，刘 蓉，薛文通，张 惠

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

四种淡水鱼致敏蛋白免疫原性研究

刘楚怡，刘 蓉，薛文通*，张 惠

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

对常见的食物过敏原，草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、乌鳢(Ophicephalus argus)、鲇鱼(Silurus asotus)、花鲈(Lateolabrax japonicus)四种淡水鱼进行了特异性抗原的识别，通过coca’s缓冲液分别于四类鱼肌肉组织中提取蛋白粗提液，经SDS－PAGE分离出多种分子量不同的蛋白组分并对其进行分析，再通过Western－blotting识别四种淡水鱼过敏原研究其免疫原性。由SDS－PAGE电泳分别得到四种淡水鱼全蛋白电泳图，通过免疫印迹等方法发现草鱼与IgE结合的阳性带主要有4条(107、62、50、27ku)，乌鳢与IgE结合的阳性带主要有6条(62、50、34、32、28、17ku)，鲇鱼与IgE结合的阳性带主要有4条(62、50、39、37ku)，花鲈与IgE结合的阳性带主要有6条(62、50、37、34、32、18ku)。

淡水鱼，免疫印迹，食物过敏原

食品过敏反应发生率呈逐年上升趋势，已成为当今世界普遍存在的问题，它严重影响到部分人群的生活质量［1－2］。食品过敏是人体对食品中的抗原物质产生的由免疫系统介导的不良反应，能够引起这种不良反应的抗原物质即为食品过敏原。据统计，90%以上的过敏反应是由8类，共170种富含蛋白质的食物引起的。作为世界粮农组织FAO(1995)报告的八类主要过敏食物中的一类，鱼类已成为最常见的食品过敏原之一［3］。美国婴幼儿鱼类过敏的发生率为0.1%，成人为0.4%［4］。瑞典和冰岛地区鱼类过敏的发生率为0.2%［5］。在亚洲，由于饮食习惯的问题，鱼类致敏的现象显得更为突出。日本调查全国范围内2001～2002年速发型食物过敏性疾病，结果指出食物过敏病例中4.4%是由鱼类引发的［6］。吕相征对中国医科大学学生的调查表明，鱼类过敏人数占总过敏人数的18.2%，对于过敏者为最多［7］。我国是世界淡水养殖大国，淡水产品产量世界第一。淡水鱼占我国渔业总量的41.5%左右。在淡水养殖品种结构中，由淡水鱼引起的过敏症在我国也最为常见，这极大地影响了我国鱼类制品的安全性，降低了其市场普及和鱼产品的利用价值。到目前为止，对食品过敏还没有非常有效的治疗方法，对于食品过敏的防治唯一有效的方法就是严格控制和避免特定食品的摄入。因此，对于淡水鱼致敏蛋白的识别，以及对其致敏性的研究，在过敏原的防治以及开发低致敏食品方面都具有重要的理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜草鱼、乌鳢、鲇鱼、花鲈 购于中国农业大学家属区市场;0.02mol/L pH7.5的Tris－HCl缓冲液、pH8.3的coca’s提取液、pH8.3的25mmol/L Tris－192mmol/L甘氨酸缓冲液、4－氯－1－萘酚、电泳所需试剂、硝酸纤维素膜(Amersham RPN303C)、立春红

sigma公司;鱼类过敏患者血清 大庆市油田总医院皮肤科;蛋白标准品 10～200ku;HRP标记的羊抗人IgE抗体;牛血清白蛋白标准品。

GL－20B高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;AE－6450垂直电泳槽、AE－8450 1000V电源 日本ATTO公司;DYY－Ⅲ7B型转移电泳仪、DYY－Ⅲ40B型转移电泳槽 北京六一仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼肉蛋白的提取 从市场买回新鲜淡水鱼，除去鱼皮、鱼骨以及内脏，取鱼肌肉，切成碎块，放入绞肉机中绞碎，加入2倍体积的 coca’s提取液(pH8.3)提取，均质机13000r/min均质5min后，在4℃下以12000r/min转速离心20min，取上清液。将上清液收集冷冻干燥后成粉状保存待用。

1.2.2 SDS－PAGE 采用不连续体系SDS－PAGE垂直板凝胶电泳，浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12.5%，恒流30mA，溴酚蓝标记电泳完成后经考马斯亮蓝R250染色20min，脱色。标准蛋白分子量范围为10～200ku之间的14种多肽。

1.2.3 转移电泳 按照进行SDS－PAGE电泳后的凝胶的大小剪取NC膜(0.45μm)。将胶和膜放入电转缓冲液中平衡20min，NC膜接正极，凝胶面接负极，在150V恒压下，于4℃冰箱中电转1.5h。电转结束后，凝胶用考马斯亮蓝R－250染色，NC膜用立春红染色，观察转移效果，转移完全的膜用于免疫印迹［8］。

1.2.4 血清池的建立 取3份阴性血清和12份鱼过敏患者阳性血清分别等体积混合，制成阴性血清和阳性血清池，300μL/tube分装于－20℃冰箱中保存。

1.2.5 免疫印迹(Western－blotting) 用2%BSA于4℃封闭过夜后，将NC膜放人10位对鱼过敏患者的血清池(1∶10稀释)中。在4℃冰箱中孵育5h，用TBST清洗3次。将NC膜转入HRP标记羊抗人IgE抗体(1∶2000稀释)中振摇0.5h，TBST清洗3次。将NC膜加入辣根过氧化物酶底物溶液显色，待条带清晰后即用双蒸水冲洗，终止显色反应。

2 结果与讨论

2.1 四种淡水鱼肌肉全蛋白电泳图

四种淡水鱼的总蛋白的SDS－PAGE电泳结果显示，其蛋白含量丰富，不同的鱼的总蛋白条带存在不同，分子量广泛分布于10～150ku之间。其中草鱼共有28条蛋白带，丰度较高的蛋白条带分子量分别为107、50、39、37、34、12ku，共6条;乌鳢共有24条蛋白带，其中丰度较高的7条蛋白条带分子量为107、62、50、39、37、34、11ku;鲇鱼共有29条蛋白带，主带为8条，分别在分子量为107、50、39、37、32、14、13、12ku处可见丰度较高的蛋白条带;而花鲈共有25条蛋白带，主带为8条，分别在107、50、39、37、35、18、14、10ku处。结果见图1。

2.2 四种淡水鱼致敏蛋白的识别

SDS－PAGE电泳后用由22位经检测对鱼过敏患者的阳性血清组成的血清池为一抗，HRP标记羊抗人IgE作为二抗，对四种鱼的总蛋白进行免疫印迹分析，结果见图2。草鱼与IgE结合的阳性带主要有4条(107、62、50、27ku);乌鳢与IgE结合的阳性带主要有6条(62、50、34、32、28、17ku)，鲇鱼与IgE结合的阳性带主要有4条(62、50、39、37ku)，花鲈与IgE结合的阳性带主要有6条(62、50、37、34、32、18ku)。

图1 四种淡水鱼蛋白SDS－PAGE电泳图

图2 鱼过敏阳性血清对四种淡水鱼蛋白Western Blotting图

3 结论

本文对常见的四种淡水鱼草鱼、乌鳢、鲇鱼、花鲈的肌肉蛋白进行了特异性抗原的识别，结果表明，草鱼存在4条致敏条带、乌鳢有6条主要致敏带、鲇鱼致敏条带为4条、花鲈存在6条蛋白带与阳性血清反应。

本研究与文献报道中鳕鱼等海水鱼的主要致敏蛋白为12ku的小清蛋白［9－10］的结论不同，在对这四种淡水鱼的免疫印记中并未发现小清蛋白引起过敏反应。四种鱼中62ku和50ku的蛋白都明显致敏，但不同种鱼引起过敏的主要蛋白仍然存在差异。分析认为其致敏蛋白存在差异与鱼类种属不同有关。虽然四种鱼都属于辐鳍鱼亚纲但分属不同目。草鱼为鲤形目草食鱼，与另外三种比较其致敏性较低，存在27ku的致敏蛋白。乌鳢和花鲈属于鲈形目，两者在34、32、17～18ku处的蛋白都引起过敏。鲇鱼是鲶形目，致敏性较鲈形目的乌鳢和花鲈低，但高于鲤形目草鱼。

淡水鱼引起的过敏症极大地影响了我国鱼类制品的安全性，降低了其市场普及和鱼产品的利用价值。因此，对于淡水鱼致敏蛋白的识别，以及对消除致敏蛋白致敏性的研究，在治疗超敏反应疾病和研究开发低致敏食品方面都具有重要的理论指导意义。

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Identification of major allergens from four kinds of freshwater fishes

LIU Chu－yi，LIU Rong，XUE Wen－tong*，ZHANG Hui
(College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Aiming to investigate the major allergens of the following four kinds of freshwater fishes，Grass carp (Ctenopharyngodon idellus)，Snakehead(Ophicephalus argus)，Catfish(Silurus asotus)and Japanese sea perch (Lateolabrax japonicus)were studied.Fish muscle was extracted in the same volume of coca’s buffer(pH 8.3).The relative contents of major allergens were quantified by SDS－PAGE densitometry.Immunoblot on the four kinds of freshwater fish protein extracts were performed with sera from 12 eczema patients with serum specific immunoglobulin E of fish proteins.In result，the major allergen of Grass carp was 107，62，50，27ku protein.There were 6 major allergic protein of Snakehead which were 62，50，34，32，28，17ku.The positive protein which were connected with the specific immunoglobulin E of Catfish were 62，50，39，37ku protein.Japanese sea perch major allergen were 62，50，37，34，32，18ku protein.

freshwater fish;western－blotting;food allergen

TS254.1

A

1002－0306(2011)11－0164－03

2010－10－13 *通讯联系人

刘楚怡(1986－)，女，博士研究生，研究方向:农产品加工与贮藏。