一株融合菌株G23产胞外多糖的流变学特性

张岩春，戴智勇，刘跃辉，李盛钰，杨贞耐

（1.湖南澳优食品与营养研究院，长沙410005；2.吉林省农业科学院农产品加工研究中心，长春130033）

一株融合菌株G23产胞外多糖的流变学特性

张岩春1，2，戴智勇1，刘跃辉1，李盛钰2，杨贞耐2

（1.湖南澳优食品与营养研究院，长沙410005；2.吉林省农业科学院农产品加工研究中心，长春130033）

融合菌株G23是由植物乳杆菌C88和发酵乳杆菌F6通过原生质体融合获得的菌株。采用动态流变仪，在不同多糖质量浓度、温度、pH值条件下测定融合菌株G23所产生的胞外多糖的流变学性质。所产胞外多糖溶液是典型的非牛顿流体，胞外多糖质量浓度的增大可提高溶液体系的黏度。在10～80℃的较大温度范围内黏度变化较小，在所测温度范围内溶液黏度基本保持不变。在不同pH值条件下，胞外多糖溶液均表现为剪切力作用下黏度迅速下降趋势。胞外多糖加入脱脂乳溶液中能够明显的增加脱脂乳的黏度，且溶液的黏度下降变慢。在试验的频率范围内，随着胞外多糖溶液质量浓度的增加，对应的交叉频率的值相应变大，胶体特征越明显。

胞外多糖；融合菌株G23；流变学特性

0 引言

随着我国乳品工业的迅速发展，乳酸菌胞外多糖将在乳品加工业中起到越来越重要的作用。在发酵过程中，乳酸菌产生的胞外多糖有利于改善产品的流变学特性，如提高产品的黏弹性、质地和口感[1]。

乳酸菌胞外多糖能够提高乳制品的流变学特性，能为生产厂家降低稳定剂和增稠剂等添加剂用量，降低生产厂家的生产成本[2]。胞外多糖突变株G23产生的胞外多糖的流变学特性黏弹性好，抗机械破坏能力强，凝固敏感性低。能满足发酵乳品的理想质地及柔滑口感的要求。

通过测定胞外多糖突变株G23的胞外多糖溶液流变学特性受多糖浓度、剪切速率、作用温度和多糖溶液pH值等因素[3]的影响，分析了该菌产生的胞外多糖的流变学特性变化，为提高乳酸菌胞外多糖在发酵乳制品中的应用效果和获得优良乳酸菌发酵剂菌株打下基础。

1 实验

1.1 材料与仪器

融合菌株G23（中国农业科技东北创新中心），脱脂奶粉（恒天然公司），三氯乙酸和琼脂糖凝胶（sigma公司），DEAE-纤维素（上海恒信公司），无水乙醇、苯酚、硫酸等均为分析纯试剂。

AR-500动态流变仪，恒温培养箱,真空冷冻干燥机，超低温冰柜，紫外可见分光光度计，高压蒸汽灭菌器,台式高速离心机，超纯水器,分析天平。

1.2 方法

1.2.1 胞外多糖提取

将融合突变菌株G23接入脱脂乳培养基，接种量为1%，pH值为6.5,温度37℃，培养32 h后取样，制取胞外多糖。

1.2.2 胞外多糖的分离纯化

取融合突变菌株G23脱脂乳发酵样品，用质量浓度800 g/L的三氯乙酸(终质量浓度为40 g/L)沉淀蛋白，在4℃下离心(10 000 r/min,15 min),去除沉淀蛋白质和菌体,重复离心两次，取上清液。2倍体积的无水乙醇加入上清液中，充分搅拌混合1 h，然后放置于4℃冰箱中过夜，用来沉淀胞外多糖。离心胞外多糖沉淀物，获得粗制胞外多糖。用蒸馏水溶解粗制胞外多糖，再次4℃下离心，胞外多糖溶液用2倍体积的乙醇再次沉淀，然后4℃离心后冷冻干燥后保存[4]。

每次处理200 mg左右的干燥胞外多糖，用15 mL蒸馏水至完全溶解。胞外多糖溶液经DEAE-纤维素离子交换柱(2.6 cm×30 cm)层析纯化。胞外多糖溶液上样到平衡好的DEAE-纤维素离子交换柱。按次序以蒸馏水,浓度为0.2 mol/L和0.5 mol/L的NaCl进行分批洗脱，流速为1 mL/min,收集器收集每管5 mL,按照测定值的正态分布吸收峰收集单峰样品，装入透析袋用蒸馏水透析，然后真空冷冻干燥。以水做流动相洗脱部分经Sepharose CL-6B凝胶层析柱进一步分离纯化。以质量分数为0.9%的NaCl溶液洗脱，流速为0.4 mL/min，洗脱液按照测定值的正态分布吸收峰收集后，经透析袋透析后冻干，获得精制胞外多糖，用于多糖的流变学特性分析。

1.3 胞外多糖的流变学分析

将先后经过DEAE-纤维素离子交换和Sepharose CL-6B凝胶层析柱纯化后的干燥精制胞外多糖用蒸馏水配制成试验条件所需的溶液，室温下磁力搅拌2h，用于多糖的流变学特性的测定。

1.3.1 质量浓度对多糖流变学性质的影响

用去离子水配制质量浓度为3，5和10 g/L的胞外多糖溶液，测定各个质量浓度胞外多糖溶液的黏度和剪切速率关系。测定条件：温度25℃，锥板(40 mm，1°)，测定模式为流体，数据获取模式为连续读取，以剪切速率为自变量，范围为0～300 s-1，扫描完成时间为10 min，变量扫描范围设定为线性，获得质量浓度对胞外多糖流变学影响的变化曲线。

1.3.2 体系温度对流变学性质的影响

用去离子水配制质量浓度为1 g/L的胞外多糖溶液，用流变仪测定并绘制胞外多糖溶液黏度随温度变化的曲线。测定条件：锥板(40 mm，1°)，测定模式为流体，数据获取模式为温度梯度升高，温度扫描范围为10～80℃，扫描完成时间为10 min，自变量为剪切速率，范围为0-100 s-1，获得温度对胞外多糖流变学影响的变化曲线。

1.3.3 体系pH值对流动性质的影响

用酸或碱调节多糖的去离子水溶液(质量浓度为1g/L)体系的pH值，使之成为中性(pH值为7.0)，酸性(pH值为4.0)和碱性(pH值为10.0)状态，流变仪测定酸碱度对胞外多糖溶液黏度的影响，测定条件为：温度25℃，锥板(40 mm，1°)，测定模式为流体，数据获取模式为连续读取，以剪切速率为自变量，范围为0～300 s-1，扫描完成时间为10 min，变量扫描范围设定为线性，获得胞外多糖溶液pH值对溶液流变学性质影响的变化曲线。

1.3.4 对脱脂乳溶液流变学性质的影响

用去离子水配制质量浓度为100 g/L的脱脂乳溶液，将胞外多糖以质量分数1.0%加入脱脂乳溶液中，同时以不添加胞外多糖的脱脂乳做对照。测定添加胞外多糖的脱脂乳溶液和空白脱脂乳溶液的在剪切速率黏度变化时的溶液黏度变化。测定过程是在温度为20℃，锥板(40 mm，1°)，测定模式为流体，数据获取模式为连续读取。以剪切速率为自变量，变量范围为0～100 s-1，变量扫描范围为线性，获得添加胞外多糖对脱脂乳溶液的流变学影响的变化曲线。

1.3.5 胞外多糖溶液的动态振荡剪切试验

质量浓度分别为3，5和10 g/L的乳酸菌胞外多糖溶液的表观黏度受剪切震荡频率影响的曲线。测定条件：锥板（40 mm，1°），测定模式为震荡，,数据获取模式连续读取，温度20℃，剪切时间10 min，控制变量为剪切震荡频率0～100 Hz。获得不同质量浓度胞外多糖溶液对溶液黏弹性影响的变化曲线。

2 结果与讨论

2.1 质量浓度对溶液流变学特性的影响

图1为多糖溶液质量浓度对溶液表观黏度的影响。由图1可以看出，在剪切速率范围(0～300 s-1)内，胞外多糖溶液的表观黏度随质量浓度的加大而增高，在比较低的剪切速率范围内，不同质量浓度的胞外多糖溶液均表现为溶液黏度随剪切速率增加而减小的典型非牛顿流体的假塑性流动行为,而在比较高的剪切速率范围内，质量浓度为10，5和3 g/L的乳酸菌胞外多糖溶液在剪切速率不大时表现为溶液黏度随剪切速率的增加而缓慢降低的假塑性流动行为，随剪切速率的随后增加而保持恒定的理想牛顿流体行为。这个结果和蓝藻ATCC 33047产生的多糖表现的非牛顿流体的假塑性流动行为类似[5]。

图1 质量浓度对溶液表观黏度的影响

2.2 温度对多糖溶液流变学特性的影响

图2为多糖溶液温度对溶液黏度的影响。由图2可知，在剪切速率范围(0～100 s-1)内乳酸菌胞外多糖溶液的黏度随着温度的上升而变化，在10～80℃的温度范围内1.0%的乳酸菌胞外多糖溶液的黏度都是比较稳定的。因为在这样大的温度范围内黏度变化不大，说明这种乳酸菌胞外多糖可以适应需要加热而保持黏度相对稳定的操作过程。而Moreno等人[6]研究发现，一种新型庭荠种子胶的30 g/L质量浓度溶液随温度的升高（5～65℃）黏度下降明显。

图2 温度对溶液黏度的影响

2.3 pH值对胞外多糖流动性质的影响

图3为多糖溶液pH值对溶液黏度的影响。由图3可以看出，质量浓度为10 g/L的乳酸菌胞外多糖溶液在pH值发生变化时，黏度变化较稳定，即在pH值为4～10范围内有很好的酸碱耐受能力。乳酸菌胞外多糖溶液的黏度值基本不随着溶液酸碱度的改变而变化，说明该乳酸菌胞外多糖能够适应各种酸碱体系环境，拓宽了该乳酸菌胞外多糖的适用范围和应用潜力。郭守军等人[7]研究发现，龙须菜多糖溶液在pH值在5～11之间，其黏度也基本稳定，在酸性溶液中，pH值为3～4时黏度还略有增加。

2.4 对脱脂乳溶液流变学性质的影响

图4为胞外多糖对脱脂乳溶液黏度的影响。由图4可以看出，突变菌株G23产生的胞外多糖对脱脂乳的质地影响显著。添加质量浓度为10 g/L胞外多糖的脱脂乳溶液的黏度比不添加胞外多糖的脱脂乳溶液的黏度显著提高，随着剪切速率的增大，溶液的黏度快速下降，显现出明显的剪切变稀作用。有研究表明，乳酸菌胞外多糖作为质地改良剂，能够明显提高乳产品的黏度，还能够通过与乳成分如蛋白质胶粒相互作用，从而增强酪蛋白网络的刚性和稳定性[8]。

2.5 动态振荡剪切实验

图3 pH值对溶液黏度的影响

图4 多糖对脱脂乳溶液黏度的影响

图5为不同质量浓度多糖溶液震荡剪切实验结果。由图5可以看出，对多糖溶液施以一定的剪切应力，乳酸菌胞外多糖表现出粘弹特性，即同时具有固体和液体的性质。储能模量G’(描述固体特性，即弹性)和损耗模量G”(描述液体特性，即黏度)的大小随胞外多糖所处的状态不同而不同。随着剪切振动频率升高(0～100 Hz)，G’和G”同时升高，并在达到一定频率时G’和G”曲线相交，交点处频率称为交叉频率。在剪切振动频率低于交叉频率时，胞外多糖主要表现为液体黏性性质，即G”＜G’。而当剪切振动频率超过交叉频率时，胞外多糖更多地表现出固体弹性性质，即G’＞G”。在试验范围内，随着胞外多糖溶液质量浓度的提高，交叉频率值也随之变大，这说明随着胞外多糖质量浓度的提高，胞外多糖溶液的胶体化程度越高，表现出更多的固体弹性性质。Gorret等人[9]研究了由丙酸菌ATCC 25562产生的多糖的溶液粘弹性，配制水溶液分别为4，8和18 g/L的胞外多糖溶液的质量浓度，得出了胞外多糖质量浓度越高，胞外多糖溶液的胶体化程度越大的类似研究结果。

图5 多糖溶液震荡剪切实验结果

3 结论

（1）融合菌株G23胞外多糖溶液是典型的非牛顿流体，溶液表观黏度随剪切速率的增大而降低，随着多糖质量浓度的升高黏度也增大，剪切稀释现象趋势一致。

（2）融合菌株G23产的胞外多糖具有很好的热稳定性，随着剪切时间的延长，溶液黏度下降较缓慢；在酸碱性环境条件下，多糖的黏度变化趋势十分一致且相对稳定。

（3）融合菌株G23多糖能够提高脱脂乳的黏度，但随着剪切速率的提高，添加胞外多糖的脱脂乳溶液的黏度下降变慢。

（4）随着胞外多糖溶液质量浓度的增加，对应的交叉频率的值相应变大，说明该胞外多糖溶液质量浓度越高，胶体特征越明显。

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Rheological properties of the exopolysaccharide produced by fusion strains G23

ZHANG Yan-chun1，2,DAI Zhi-yong1,LIU Ye-hui1,LI Sheng-yu2,YANG Zhen-nai2
(1.Food and Nutritional Institute of Hunan Ausnutria,Changsha 410005,China；2.Center of Agro-food Technology,Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130033,China)

Fusion strain G23 was obtained by protoplast fusion of Lactobacillus plantarum C88 and Lactobacillus fermentum F6.The solution rheology of exopolysaccharide produced by fusion of strain G23 was measured by dynamic rheometer at different polysaccharide concentration,temperature,pH values.The exopolysaccharide solution is a typical non-Newtonian fluid.The increasing the concentration of extracellular polysaccharides can improve the viscosity of aqueous solution.The viscosity of extracellular polysaccharide solution produced by fusion mutants G23 had little change at the range of 10～80℃,the extracellular polysaccharide display a thermal stability properties in the measured temperature range.And the viscosity of the extracellular polysaccharide solution remained unchanged with the shearing time extension.In different pH values,the extracellular polysaccharide solution showed the rapid decline when the shear rate increased.The skim milk solution by adding exopolysaccharide can significantly increase the viscosity,and with the shear rate increases,the decrease rate of viscosity of skim milk added exopolysaccharide became slow.In the measured frequency range,with the increasing concentration of exopolysaccharide increased the corresponding value of the crossover frequency,which meant that the higher the concentration of exopolysaccharide solution showed the more obvious colloid features.

exopolysaccharide；fusion strains G23；rheological properties

Q936

A

1001-2230（2011）02-0021-03

2010-09-08

张岩春(1976-),男,博士研究生,研究方向为畜产品加工。